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Q&A

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DNA Blunting Kit

Q1 1回の反応で平滑末端化できるDNA量は?
A1 直鎖状にしたpUC18 DNA(2686 bp)で約0.1~10 μg(DNA5'末端濃度に換算すると約0.1~10 pmol)が平滑末端化できます。1~2 μgが至適量です。

Q2 DNA Blunting Kit中のLigation Solution A液、B液はDNA Ligation Kit Ver. 2で代用できるか?
A2 Ligation Kit Ver. 2はVer. 1よりも反応スケールを落とすために、DNA溶液と等量のⅠ液を混合するように設計されています。そのため、DNA溶液の組成による影響を比較的受けやすく、Blunting Kit中のLigation Solution A液、B液の代わりにLigation Kit Ver. 2を使用するとライゲーションされないことがあります。Ver. 2をお使いになる際は、DNA溶液を一旦フェノール抽出、エタノール沈殿させてから反応に供してください。

Q3 PCR産物をDNA Blunting Kitで平滑末端化した後、ベクターにライゲーションする際に5'末端をリン酸化する必要はあるか?
A3 あらかじめ5'末端がリン酸化されたプライマーを使わない限りPCR産物の5'末端にはリン酸が付加していません。脱リン酸化されたベクターとライゲーションする際にはT4 Polynucleotide Kinaseでリン酸化する必要があります。 DNA Blunting Kitにて末端平滑反応後、フェノール/クロロホルム抽出にて完全に酵素を除去します。その後T4 Polynucleotide Kinaseでリン酸化し、65℃、10分間で熱失活させた後の反応液を、そのままライゲーションに用いることができます。

Q4 DNA Blunting Kitを用いて平滑末端化したインサートをベクターとライゲーションする際、効率を高める方法は?
A4 突出末端DNAと比較して平滑末端DNAのライゲーションは効率が下がります。Ligation Solutionにてovernight反応を行う等、反応時間をのばしても改善されない場合は、ライゲーション反応後の溶液に終濃度500 mMになるようにNaClを加えて形質転換を行ってください。塩を加えることにより形質転換の効率を上げることができます。

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