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Q&A

siRNA Ladder Marker

siRNA Ladder Marker

Q1 このマーカーの利点は?dsRNAを取り扱う際、DNAマーカーでは不適当か?
A1 DNAとRNAでは分子量に違いがあり、電気泳動の際、特に低分子側での影響が大きくなります。siRNA混合物の調製時にDNAマーカーを使用すると、21 mer付近のdsRNA分解産物を正確に判断することが難しくなりますので、siRNA Ladder Markerの使用をお勧めします。また、siRNA調製用の基質となるdsRNAは、300 bpから長くても1,000 bp程度ですので、これらのサイズ確認のためにも利用できます。

Q2 SYBR Green Iなど検出感度の高い核酸染色試薬でマーカーを染めるとバンドがくっついたように見えることがあるが?
A2 アプライ量を1/5~1/10に減らしてください。

Q3 dsRNAの末端は、siRNAの場合と同様に3'末端に2塩基突出となっているのか?
A3 各フラグメントは平滑末端です。一本鎖部分があると切断をうけやすくなり、分子量がずれてしまう可能性があるため、平滑末端にしています。分子量は平滑末端でも同じであるので用途的には問題ないと考えられます。

Q4 きれいに泳動できる条件は?
A4 15%ポリアクリルアミドゲルを使用してください。泳動Bufferは0.5×TBEを使用しています。なお、泳動後は比較的長め(30分程度)にエチジウムブロマイド染色を行うことをお勧めします。

Q5 マーカーが薄くなってきたように感じるが?
A5 サンプルがきれいに検出されている場合は、マーカーの劣化が考えられます。dsRNAは通常、ssRNAよりも分解を受けにくく安定と考えられていますが、なるべくRNaseフリーの環境で使用してください。プラスミド調製を頻繁に行っている所での使用はお勧めできません。また、室温での放置は避けてください。

Q6 合成したsiRNAは21 merだが、マーカーと比べると違う長さに見えてしまう。
A6 合成siRNAの末端には2塩基のDNAが付加されていることが多く、DNAの分子量がRNAよりも小さいため、マーカーとは若干ずれて見える場合があります。また、塩基配列によっても若干のズレが生じることが考えられます。

Q7 断片によって、濃さが違うような気がするが?
A7 エチジウムブロマイド染色時の偏りが考えられます。できれば、ゆっくりと振とうしながら染色を行ってください。なお、100 bpのバンドは他のバンドよりも意図的に濃くしてあります。

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