Q1 プライマー設計で注意することは?
A1 以下の点を考慮してプライマーを設計してください。
- 通常は20~25 merのプライマーを使用します。PCR条件に適したTm値のプライマーを設計することが大切です。詳細は各製品の取扱説明書をご参照ください。
- 10 kb以上の長鎖を増幅する場合、25~35 merのプライマーで良い結果が得られる場合があります。また、Tm値(下記の式*1で計算)が65℃以上になるようにプライマー設計ソフト*2を利用して設計することをお勧めします。
- GC含量が50~60%となるようにし、プライマーの3’側10塩基のGC含量が高くならないように配慮することで、より特異的な増幅が期待できます。また、3’末端の塩基はミスプライミングの頻度が高いTを避けることをお勧めします。
- ForwardプライマーとReverseプライマーがアニーリングしないように設計してください。特に3’末端で3塩基以上が相補的な配列にならないように注意してください。また、ForwardプライマーとReverseプライマーのTm値はなるべく揃うように設計してください。
- プライマー内での二次構造形成を避けるため、自己相補的な配列を含まないよう注意してください。
- GCリッチなターゲットの場合、Tm値が60℃を超えるプライマーを推奨します。
- 異なるプライマー対を用いた複数の増幅反応を同一条件で行いたい場合は、使用酵素、PCR条件に合わせてTm値が適切になるよう各プライマーを設計することをお勧めします。
*1 Tm値の計算方法
Tm値(℃)=2(nA+nT)+4(nC+nG)+35-2(nA+nT+nC+nG)
*2 プライマー設計用ソフト
Primer3(http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/software/)OLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights社)
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Q2 最適な鋳型量は?
A2 ゲノムDNA やプラスミドDNA、逆転写産物など用いる鋳型の種類によって、PCRに適した鋳型量は異なります。
特に
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(製品コード R010A/B)の場合には、過剰量の鋳型が増幅を阻害する傾向がありますのでご注意ください。また、
PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品コード R045A/B)については鋳型の種類や量、質に応じて反応条件を調整することにより柔軟に対応することが可能です。
以下に標準的な鋳型推奨量を示します。
(50 μl反応系)
・ヒトゲノムDNA:5~200 ng
・E. coli ゲノムDNA:100 pg~100 ng
・cDNA ライブラリー:1~200 ng
・λDNA:10 pg~10 ng
・プラスミドDNA:10 pg~1 ng
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Q3 PCR条件で注意することは?
A3 以下の点を考慮してください。
- PCRサイクル前のプレヒート(初期変性)について
MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(製品コード R076A/B)には98℃までポリメラーゼ活性を抑制する強力な抗体を使用しているため、98℃ 2分のプレヒートが必要です。
上記以外のタカラバイオのPCR酵素では活性化のためのプレヒートは必要ありません。ゲノムDNA等の複雑な鋳型の変性のために必要に応じてプレヒートを行う場合も、94℃ 1分で十分です。過度の加熱処理は酵素失活の原因となります。
- 変性条件について
変性条件はサーマルサイクラーの機種とチューブの種類を考慮して設定してください。設定の目安としては94℃の場合は20~30秒、98℃の場合は5~10秒です。Taq系試薬(Taq、Ex Taq、LA Taq、Dye入り試薬、SpeedSTAR)をTakara機種で使用した場合は、98℃ 10 secを推奨します。他社機種(設定温度より温度が高くなりやすい機種)を使用する場合は、94℃ 30 Secを推奨します。
より耐熱性に優れるPrimeSTARシリーズの場合は、98℃ 5~10秒の高温短時間の変性条件をお勧めします。
TaKaRa Taq HS Perfect Mix(製品コード R300A/B)およびTaKaRa Taq HS Low DNA(製品コード R090A)の場合、変性条件は必ず94℃ 5秒に設定してください。95℃以上の設定では、酵素の失活による反応性低下が起こり、増幅産物が得られない場合があります。
- アニーリング条件について
アニーリング条件により増幅効率と増幅の特異性が変化します。プライマーのTm値に対し低すぎるアニーリング温度を設定すると、ミスプライミングに起因する非特異的増幅産物やスメアが増加し、目的増幅産物が減少する場合があります。プライマーのTm値に対し高すぎるアニーリング温度を設定すると、プライミング効率が低下し目的増幅産物が減少します。プライマーのTm値を考慮してアニーリング温度を調整したり、2 step PCRを行うことにより増幅の効率や特異性をより改善できる場合があります。
Taqシリーズの場合、アニーリング時間は30秒をお勧めします。プライミング効率に優れるPrimeSTARシリーズの場合は、5~15秒の短いアニーリング時間に設定することが重要です。アニーリング時間が長すぎるとミスプライミングに起因する非特異的増幅産物やスメアが現れる場合があります。
1 kb以下の短い鎖長を増幅する場合、3 step PCRをお勧めします。GCリッチなターゲットや10 kbを超える長鎖を増幅する場合には、2 step PCRをお勧めします。
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