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Q&A

NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up

NucleoSpin Gel and PCR Clean-up

Q1 アガロースの溶解が十分にできない。
A1
アガロースの量が多すぎる
  • 高濃度のアガロースの場合は、Buffer NTの量を2倍にして使用してください。
温度と時間が適切でない。
  • インキュベーション時間をチェックしてください。ゲルの重量に応じて、インキュベーション時間を20分まで延長することができます。(英文説明書セクション5のステップ1参照)2分ごとにボルテックスし、ゲル切片の溶解の度合いをチェックしてください。非常に大きなゲル切片の場合は、Buffer NTを加える前にゲルを細かくしておいてください。
Q2 DNAの収量が低い。
A2
Wash Buffer NT3の調製が正しくない。
  • 指定された量の96~100%エタノールをBuffer NT Concentrateに加え、使用前に十分に混合してください。
ゲル切片が十分に溶解していない。
  • Q1を参照してください。
シリカメンブレンの乾燥が不十分
  • Buffer NT3(エタノールを含む)を完全に除去するために、11,000×gで5分間遠心するか、あるいは溶出前にカラムを70℃で2~5分間インキュベートしてください。Collection Tubeを遠心機から取り出し、ろ液を除く課程で、スピンカラムの先をろ液に接触されないように注意してください。
溶出バッファーの量が十分でなかった。
  • 特に多量(>5 μg)のDNAがメンブレンに結合している場合は、溶出バッファー(Buffer NE)の量を100 μlまで増やしてください。
DNAフラグメントのサイズが大きい。(5~10 kb)
  • あらかじめ70℃に加温した溶出バッファー(Buffer NE)をスピンカラムに加え、遠心前に室温で2分間インキュベートしてください。
PCR Bufferの影響
  • MightAmp DNA Polymerase Ver.2(製品コード R071A)などのMightyAmpシリーズのPCR酵素やTks Gflex DNA Polymerase(製品コード R060A)を用いて増幅したPCR産物の場合は、PCR反応液を滅菌水で、1.5~2倍に希釈し、希釈した溶液の2倍量のBuffer NTIを加えてください。
Q3 回収したDNAをアガロースで電気泳動すると、本来のサイズ以外のバンドがでる。
A3
溶出に滅菌水を使用したり、アガロース電気泳動でイオン含量の低いアガロースを用いると、変性(一本鎖)DNAが形成される場合がある。
  • DNAの再アニーリングを行ってください。目的の酵素反応を行う際に、酵素以外のコンポーネントを加え、95℃で2分間インキュベートした後、反応液を室温までゆっくり冷ましてください。(このステップでDNAが再アニーリングします。)そのあと、酵素を加えて目的の実験を行います。
Q4 抽出したDNAを用いてシーケンス、制限酵素切断、ライゲーション反応がうまくいかない。
A4
エタノールや、Buffer NT3(エタノールを含む)の持ち込みがある。
  • Buffer NT3(エタノールを含む)を完全に除去するために、11,000×gで5分間遠心するか、あるいは溶出前にカラムを70℃で2~5分間インキュベートしてください。Collection Tubeを遠心機から取り出し、ろ液を除く課程で、スピンカラムの先をろ液に接触されないように注意してください。
試薬由来のカオトロピック塩の持ち込みがある。
  • カオトロピック塩を含むBuffer NTを完全に除去するために、洗浄ステップを以下の1)または2)の改変プロトコールで行ってください。
    この改変プロトコールを行う場合は、キットに含まれるBuffer NT3 Concentrateの量では不十分で、別途Buffer NT3 Concentrate(製品コード 740598)が必要です。
    1)メンブレンの乾燥ステップで、Buffer NT3 250 μlをカラムに添加し11,000×gで2分間遠心する。ろ液を捨てた後、さらに11,000×gで2分間遠心する。
    2)メンブレンの洗浄ステップで、Buffer NT3 700 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心するステップを2度行う。その後、メンブレンの乾燥ステップを1)の通り行う。
Buffer NT以外のバッファー、例えばTE Bufferを用いてDNAを溶出した。
  • EDTAは酵素反応を阻害する場合があるので、溶出はBuffer NEまたは滅菌水で行ってください。
シーケンス反応に用いたDNA量が不十分だった。
  • シーケンスを行う前に、アガロース電気泳動などでDNAの定量を行ってください。
UVライトでDNAが損傷した。
  • アガロースゲルからDNAを切り出す際、UVライトの照射はできるだけ短い時間で行ってください。
Q5 NanoDrop分光光度計またはAgilent社のバイオアナライザーでDNAの定量ができない。
A5
微量のシリカ粒子の持ち込みがある。
  • NanoDrop分光光度計などは、サンプル中の粒子の影響を強く受けます。シリカ粒子を沈殿させるために、溶出したDNA溶液を11,000×gで2分間以上遠心し、その上清を使用してください。
Q6 OD260/OD230の比が低い。
A6
試薬由来のカオトロピック塩の持ち込みがある。
  • Q4.を参照してください。
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