この画面を閉じる

Q&A

Q&ATopへ

ThruPLEX® DNA-seq Kit Q&A

全表示/全非表示
Q1 ThruPLEX DNA-seq Kitと他社ライブラリー調製キットとの違いは?
A1  ThruPLEX DNA-seq Kitは、現在市販されているキットの中で最速かつ最高感度のライブラリー調製キットです。特許取得のエンドリペア、ライゲーション、増幅の、簡単な3ステップで構成されており、全操作は1本のチューブ内で行われます。
・インプットDNA量:0.05~ 50 ng
・精製ステップ:不要(PCR増幅後のみ)
・ライブラリー作製のステップ数:3
・ライブラリー作製の時間:2時間
・サンプルを移す回数:0
Q2 増幅反応に高フィデリティー酵素が使用されているか?
A2  はい。ThruPLEX DNA-seq Kitには正確性が高く、増幅効率が高く、バイアスの少ないDNAポリメラーゼが使用されています。
Q3 ThruPLEX DNA-seq KitはGCリッチ領域も均一なカバレッジが得られるか?
A3  はい。ThruPLEX DNA-seq KitはGCリッチ領域でも均一なカバレッジが得られます。
Q4 ThruPLEX DNA-seq Kitはどんなサーマルサイクラーが使用できるか?
A4  ThruPLEX DNA-seq Kitは、50 μlの反応液量に対応できるサーマルサイクラーを使用する必要があります。ご自身のPCR機器のマニュアルをご確認ください。
Q5 ThruPLEX DNA-seq Kitで変性/一本鎖DNAは使用できるか?
A5  いいえ。ThruPLEX DNA-seq Kitで使用するDNAは二本鎖でなければなりません。
Q6 DNA断片化は必要か?
A6  はい。DNAサイズが>1 kbの場合、ThruPLEX DNA-seq Kitに使用する前に断片化してください。
Q7 DNA断片化にはどんな方法が利用できるか?
A7  DNA断片化は、物理的(Covaris、Bioruptorなど)、または酵素的な方法が利用可能です。
Q8 Covarisによる断片化にはどのくらいの量のDNAが必要か?また、断片化に使用するバッファーの種類は?
A8  バッファーは50~130 μlのTEまたはLow TEバッファーが適当です。断片化には2~50 ngのDNAを用います。
Q9 Covarisによる断片化はどんな条件で実施するか?
A9  断片サイズに応じてCovarisの推奨条件を設定する必要があります。詳細はCovarisのウェブサイトをご参照ください。
Quick Guide断片化プロトコール
http://covarisinc.com/applications/dnarna-shearing-for-ngs/
Q10 Fragmentaseに関する情報はどこで入手できるか?また、ThruPLEX DNA-seq Kitで使用するにはどのようにしたらよいか?
A10  各提供メーカーから入手してください。
Q11 シーケンスに使用可能なThruPLEX DNA-seqライブラリーを作製するには、キットに含まれている試薬の他にどのような試薬が必要か?
A11  ThruPLEX DNA-seqライブラリー作製後、Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter社、Code No.A63880)を使用してサンプルを精製する必要があります。
Q12 ThruPLEX DNA-seq Kitの試薬は、全てボルテックスによって混合できるか?
A12  いいえ、使用前にバッファーとNuclease Free Waterはボルテックスし、軽くスピンダウンしてください。酵素はピペッティングによって穏やかに混合後、スピンダウンしてください。インデックスプレートは使用前に軽くスピンダウンしてください。
Q13 ThruPLEX DNA-seq Kitの保存温度は?
A13  ThruPLEX DNA-seq Kitは-20℃で保存してください。
Q14 ThruPLEX DNA-seq Kitはメチル化研究に使用できるか?
A14  いいえ。メチル化解析には使用できません。
Q15 ThruPLEX DNA-seq Kitで作製したライブラリーは、マイクロアレイまたはPCR分析に使用できるか?
A15  はい。
Q16 ThruPLEX DNA-seq Kitの推奨インプットDNA量は?
A16  ThruPLEX DNA-seq Kitは、50 pg~50 ngのインプットDNAを増幅するように設計されています。インプット量は、必要とされる多様性のレベルや用途に依存します。下記の表はヒトDNAを用いた場合の推奨値ですが、実際のインプット量は使用するサンプル、目的によって異なります。
アプリケーション インプットサンプル(50~500 bp ds DNA)推奨インプット量
WGS, WES, SNV, indels, SNP, STRgDNA
FFPE DNA
plasma DNA
10~50 ng
100 ng
1~50 ng
CNVplasma, gDNA or FFPE DNA50 pg~100 ng
ChIP-seqChIP DNA50 pg~50 ng
RNA-seqcDNA50 pg~50 ng
Q17 リアルタイムPCRにおすすめの蛍光色素は?
A17  EvaGreen蛍光色素(Biotium社、Code No.31000、EvaGreen Dye、20×水溶液)は高感度で、ThruPLEX DNA-seqキットの増幅反応への影響が少ないため適しています。
Q18 添付のIndexing Reagentを使用する必要はあるか?マルチプレックス解析にはどのインデックスを使用するとよいか?
A18  チューブまたはマイクロプレートの形で添付されているIndexing Reagentは、イルミナ社NGS対応のインデックスを含む増幅プライマーで構成されており、ThruPLEX DNA-seqライブラリー増幅に使用する必要があります。キットに含まれるインデックスの全種類を全て使用しない場合は、ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のAppendix 1 low level multiplexing and index pooling guidelineをご参照ください。
MiSeq RTA v1.17.28以降では、low-plexity Indexのリードは全てのアプリケーションで処理できるので、インデックスの塩基対多様性はIllumina Experiment Managerによってチェックされなくなりました。従って、どの様なインデックスの組み合わせでもMiSeqでのシーケンスに使用可能です。
Q19 外部に委託して合成したインデックスオリゴは使用できるか?
A19  いいえ。インデックスはRubicon Genomicsによって開発され特許取得された技術の一部です。
Q20 PCR増幅を行わずにライブラリーを調製できるか?
A20  いいえ。ThruPLEX DNA-seqライブラリー増幅反応のStage5で、最低でも2サイクルのライブラリー増幅を行う必要があります。ライブラリー増幅ステップの詳細については、ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のD.III.をご参照ください。
Q21 ライブラリー増幅反応に必要な最適なPCRサイクル数の決定に推奨される方法は何か?
A21  ライブラリー増幅に最適なPCRサイクル数の選択の詳細については、ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のD.III.をご参照ください。
Q22 リアルタイムPCR装置なしでThruPLEX DNA-seq Kitを使用できるか?その場合、PCRサイクル数はどの様にして決めるのか?
A22  はい、ThruPLEX DNA-seq KitはリアルタイムPCR装置がなくても使用できます。ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のD.III.の表を参考にして、使用したDNAインプット量に基づいてPCRのサイクル数を選択してください。
Q23 増幅後のライブラリーは、精製または追加増幅を行うまで保存できるか?
A23  未精製のThruPLEX DNA-seqライブラリーは、精製または追加増幅を行うまで、-20℃で7日間まで保存できます。
詳細についてはThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のE.III.をご参照ください。
Q24 ThruPLEX DNA-seq Kitで調製したライブラリーは、濃度または収量が十分でない場合に追加増幅を行うことはできるか?
A24  はい。ThruPLEX DNA-seqライブラリーは、4℃で最大6時間、または-20℃で最大7日間保存後、試薬を追加することなく更に増幅することができます。ライブラリー処理ワークフローについてはThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のE.I.を、追加増幅サイクルの実施手順についてはE.III.をご参照ください。
Q25 ThruPLEX DNA-seqライブラリーをAMPure XPで精製した後さらに増幅することはできるか?
A25  いいえ、できません。
Q26 ThruPLEX DNA-seq Kitで作成したライブラリーはどれくらいの収量が期待できるか?
A26  期待される収量は100 ng~1 μgです。ライブラリーの収量は、サンプルの種類、断片化サイズ、使用するサーマルサイクラー等によって異なります。Covarisで断片化した平均サイズが200 bpの推奨増幅サイクル数で増幅した場合、reference DNAの一般的な収量は300 ng~700 ngです。
Q27 ライブラリーの定量はいつ実施すべきか?
A27  ライブラリーの定量はシーケンスの前に行います。
通常、定量はAMPure XP精製ステップの後に行いますが、プール前にサンプルを標準化するために、ライブラリー増幅反応直後にライブラリーを定量することもできます。
収量に懸念がある場合は、ライブラリーの精製を必要としない定量法を用いてください。
ライブラリー作製後のライブラリー処理ワークフローについてはThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のE.I.を、ライブラリーの定量手順についてはE.II.をご参照ください。
Q28 AMPure XPによる精製の前後でThruPLEX DNA-seqライブラリーの定量を行う必要があるか?
A28  いいえ、個別またはプールされたライブラリーの定量が必要なのはシーケンスの前のみです。ライブラリー増幅反応後にライブラリーを定量する場合も、AMPure XP精製ステップでDNAがロスする可能性があるため、シーケンスの前に精製後のライブラリーの最終定量を行うことおすすめします。
Q29 ThruPLEX DNA-seq Kitで調製したライブラリーをAMPure XPで精製する際に、特別な考慮事項はあるか?
A29  はい、ビーズ:サンプル比は1:1で使用することを推奨します。加えて、全ての洗浄ステップで80%エタノールは用事調製したものでご使用ください。
NGS用ThruPLEX DNA-seqライブラリーのAMPure XP精製に関する詳細な説明は、ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のE.V.をご参照ください。
Q30 ThruPLEX DNA-seq Kitで調製したライブラリーのシーケンスには、どのイルミナ社NGSシステムが使用できるか?
A30  ThruPLEX DNA-seq Kitで調製したライブラリーは、HiSeq、MiSeq、NextSeq 500、GAIIx等、全てのイルミナ社NGSプラットフォームに対応しています。
Q31 どれくらいの濃度のThruPLEX DNA-seqライブラリーをフローセルにロードすればよいか?
A31  ご使用のフローセルの最適ローディング濃度については、イルミナ社の推奨に従ってください。
Illumina MiSeq, v3でのシーケンスには、14~15 pMのThruPLEX DNA-seqライブラリーをロードすることを推奨します。
Q32 ThruPLEX DNA-seqライブラリーをフローセルにロードする際に特別なステップは必要か?
A32  いいえ、ThruPLEX DNA-seqライブラリーは、TruSeq Nano DNA HT Sample Prepキット等のイルミナ社NGS用ライブラリー作製キットと同様に使用できます。
Q33 フローセルにロードする前に、PhiXをライブラリーにスパイクすることは推奨されているか?
A33  イルミナ社はほとんどのライブラリーに1%のPhiXを添加することを推奨しています。多様性の低いライブラリー、またはシーケンスに問題がある場合は、PhiX Controlを少なくとも5%まで増やしてください。
シーケンスに関するその他の推奨事項については、ThruPLEX DNA-seqキット取扱説明書のE.VII.をご参照ください。
Q34 ThruPLEX DNA-seq Kitはシングルインデックスまたはデュアルインデックスを使用するか?
A34  ThruPLEX DNA-seq 48D Kitおよび96D Kitは、96ウェルプレートに分注されたイルミナ社NGS対応のデュアルインデックスを使用します。 ThruPLEX DNA-seq 6S(12 )Kit、12S(48 )Kit、および48S Kitは、チューブまたは96ウェルプレートに予め分注されたシングルインデックスを使用します。
Q35 ThruPLEX DNA-seq Kitは、どのデュアルインデックスを用いているか?
A35  ThruPLEX DNA-seq 48D Kitおよび96D Kitは、Illumina TruSeq HT i5およびi7デュアルインデックスと同一の8塩基のデュアルインデックスを用いてます。i5インデックスはD501~D508配列を持ち、i7インデックスはD701~D712配列を持ちます。デュアルインデックスの詳細については、ThruPLEX DNA-seq Kit取扱説明書のAppendix 1をご参照ください。
Q36 ThruPLEX DNA-seq Kitは、どのような種類のシングルインデックス用いているか?
A36  ThruPLEX DNA-seq 6S(12)Kit、12S(48)Kit、および48S Kitは、英国ケンブリッジのWellcome Trust Sanger Instituteによって開発された8塩基のシングルインデックス配列を用いています。Sangerインデックス配列の詳細については、Nature Methods7,111-118(2010)をご覧ください。シングルインデックスの詳細とIllumina Experiment Managerのサンプルシートの設定については、ThruPLEX DNA-seqキット取扱説明書のApppendix 1をご参照ください。
Q37 デュアルインデックスライブラリーのインデックスのうち、片方だけを使用することは可能か?
A37  いいえ、デュアルインデックスライブラリー用のThruPLEX DNA-seq Kitサンプル調製には、両方のインデックスが必要です。2ndインデックス(i5)を用いないシングルインデックスシーケンスを行う場合は、個々のサンプルを区別するためにプールしたライブラリーは、異なるi7インデックスを付加しなければなりません。イルミナ社次世代シーケンサーは、インデックス1(i7)のみを使用するシングルインデックスシーケンス法がサポートされています。8塩基シングルインデックスシーケンスのセットアップについての詳細は、機器のユーザーガイドをご参照ください。

この画面を閉じる