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PicoPLEX® WGA Kit Q&A

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Q1 PicoPLEX WGA Kitはどような用途に使用できるか?
A1  本キットは以下の用途に使用できます:
・コピー数多型(CNV)解析:BACアレイやオリゴアレイ解析
・SNPジェノタイピング
・PCRによる変異検出
Q2 細胞回収後に細胞を洗浄する必要があるか?
A2  はい、細胞外のDNAや増殖培地の混入を最小限に抑えるために、細胞は洗浄する必要があります。PBS(Ca、MgおよびBSAフリー)で洗浄し、洗浄バッファーの持ち込みは2.5 μl以下にすることを推奨します。
Q3 PicoPLEX WGA Kitを使用する前に、シングルセルの洗浄に使用できる吸着を抑える洗浄バッファーはあるか?
A3  弊社では検証していませんが、一部のユーザーはポリビニルアルコール(PVA;例えば0.1%)を含んだPBSを細胞の洗浄/回収に使用して成功しています。さらに、洗浄/回収バッファーに用いるPBSには、Ca、Mgフリーのものを使用する必要があります。
Q4 PicoPLEX WGA Kitに適した細胞の回収方法は?
A4  ソーティング、希釈およびマイクロマニュピレーションで回収した細胞が使用できます。
Q5 セルソーティングを行う場合に注意する点はあるか?
A5  細胞を固定しないことと、サンプルの分取・回収に光散乱または位相差を使用することを強く推奨します。うまく分取された細胞の顕微鏡/目視確認を行うことにより、分取条件を最適化することができます。
Q6 PicoPLEX WGA Kitのサンプルインプット量は?
A6  本キットのサンプルインプット量は、1反応あたり5 μlです。細胞およびPBSバッファーの持ち込み量は2.5 μlまでですので、細胞が1×PBS中に溶解している場合、インプット量は2.5 μl以下にしてください。
Q7 PicoPLEX WGA Kitの増幅産物を直接NGSに用いることはできるか?
A7  いいえ、NGSにはPicoPLEX DNA-seq Kitをご使用ください。
なお、弊社ではPicoPLEX WGA KitのNGSへの応用をサポートしていませんが、参考までに以下の文献をご確認ください。
Yang et al. (2011) PNAS 108(1): 12-17.
個々のヒト染色体のハプロタイプを推測するために、PicoPLEX WGA Kitで増幅したシングルコピー分取染色体をNGS解析。詳細なプロトコールは方法の項に記載。
Leung et al. (2012) PNAS 109(20): 7665-7670.
マイクロフリューディスクデバイス上でPicoPLEX WGA増幅を用いたシングルの菌体のNGS解析。方法を明らかにしていないが、結果が提供されている。
Q8 Sigma-Aldrich社で販売しているGenomePlex WGA Kitは、PicoPLEX WGA Kitと同じ技術を用いているか?
A8  いいえ。
Q9 PicoPLEX WGA Kitの増幅産物で予想されるゲノム遺伝子座表現とヘテロ接合性の喪失(LOH)は?
A9  以下の第三者から入手したデータをご参照ください。
SNPジェノタイピング方法シングルセル増幅成功率SNPコール率LOH
PCR95%>95%<10%
Illmina Infinium SNP array95%50~60%7~12%
Q10 本キットの増幅産物は一本鎖か、二本鎖か?
A10  PicoPLEX WGA Kitの最終産物は、一本鎖と二本鎖の混合物です。
Q11 PicoPLEX WGA Kitの所用時間は?
A11  PicoPLEX WGA Kitは、細胞の溶解からDNAの増幅まで3時間以内で完了し、2~5 μgの増幅産物が得られます。
Q12 PicoPLEX WGA Kitで使用可能なサンプルは?
A12  本キットで使用できるサンプルは以下の通りです:
・一本鎖または二本鎖DNA
・インタクトまたは断片化したDNA
・インプットサイズ:500 bp以上
・1~10個のヒト細胞または1,000~10,000個のバクテリアセル
・単離されたDNA(6~60 pgのヒトDNA)
・ソートした染色体
Q13 PicoPLEX WGA Kitでうまく増幅できた細胞の種類は?
A13  シングルセルの割球、極体、トロホブラスト、羊膜細胞および培養細胞由来のDNAがうまく増幅されています。
Q14 本キットの保存条件は?
A14  PicoPLEX WGA Kitは-20℃で保存してください。
Q15 この技術の特長は何か?
A15  他のWGA技術と比べてPicoPLEX WGA Kitの最大の利点は、シングルセルを使用しながらも細胞間の再現性が良いことです。またこの技術は、バックグラウンドが非常に低いのも特長です。
Q16 PicoPLEX WGA Kitのプロセスはどれくらい強力か?
A16  PicoPLEX WGA Kitを用いると、増幅よりも分取の不確実性によって制限されますが、ソーティングで分取した培養細胞で約90%の増幅効率が得られます。シングルセルからは、常に再現性のある高収量の増幅されたゲノムDNAが得られます。バッファーのみのネガティブコントロールからは、バックグラウンドがほとんど生じません。
Q17 PicoPLEX WGA Kitはゲノム遺伝子座を再現性よく増幅できるか?
A17  はい、シングルセルを用いた反応でqPCRのCtデータの相関係数は約90%でした。
Q18 バッファーのみのコントロール反応はシングルセルからの反応と区別できるか?
A18  はい、PicoPLEX WGA Kitは、単一コピー感度と高い特異性で増幅します。
Q19 PicoPLEX WGA Kitはジェノタイピングに使用できるか?
A19  はい、PicoPLEX WGA Kitは、同じ遺伝子座が異なる細胞間で再現性よく増幅されるのでSNPジェノタイピングに適しており、よく表現される領域内に含まれるSNPを、他のWGA法で見られる確率的な脱落やノイズなしに正確に検出できます。
Q20 PicoPLEX WGA KitはゲルベースのSTRジェノタイピングに使用できるか?
A20  PicoPLEX WGA KitはゲルベースのSTRジェノタイピングには最適化されていません。
Q21 PicoPLEX WGA KitはプローブベースのqPCRおよびシーケンスアッセイに使用できるか?
A21  はい、アンプリマーが250 bp以下であれば使用できます。
Q22 BACとオリゴヌクレオチドアレイでうまく結果を得るにはどうすればよいか?
A22  PicoPLEX WGA Kitによって導入される遺伝子座特異的バイアスを標準化するために、サンプルDNAとレファレンスDNAの両方をPicoPLEX WGA Kitを用いて増幅することを強く推奨します。
Q23 マイクロアレイ用にPicoPLEX WGA Kitの産物を標識する方法は?
A23  ランダムプライム標識および化学標識です。
Q24 アレイおよびqPCRアッセイに必要な増幅DNAの量は?
A24  マイクロアレイには、アレイの取扱説明書で推奨されている量から始め、結果をさらに改善するために必要に応じて量を最適化することを推奨します。
qPCRアッセイには、5~200 ngの増幅したPicoPLEX WGAライブラリーの使用を推奨します。

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