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Protocols

pAUR112 DNA

酵母Saccharomyces cerevisiae の形質転換(酢酸リチウム法)

Aureobasidin A(製品コード 630466)
キット以外に必要な試薬

YPD 培地 1%Yeast extract、2% Polypeptone、2% D-glucose
YPD 寒天培地 YPD培地に2%の寒天を加える。
選択培地 ≧ 0.5 μg/ml Aureobasidin Aを含むYPD寒天培地。
  ※使用する宿主株によってAureobasidin Aに対する感受性が若干異なる。

Aureobasidin A ストック溶液 500 μg/mlとなるようにエタノールまたはメタノールに溶解。
4℃保存(長期保存可)。
Carrier DNA サケ精子DNA(10 mg/ml)を超音波処理で切断(3 kbp~15 kbp)後、10分間、100℃処理し急冷後、使用する。
Solution A 0.1M Lithium acetate、10 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA *1
Solution B 40 g Polyethylene Glycol 4000を100 ml Solution Aに溶解する*1。(要時調製*2

*1 Solution A、 Bはフィルター滅菌する。
*2 Solution Bは形質転換効率を高めるために要時調製すること。
操作手順

1.一晩30℃で培養した酵母の培養液0.5 mlを50 mlのYPD培地に加える。
2.30℃でOD660=1~2(二倍体では2~4)となるまで培養する(約6時間)。
3.1,000×g、 5分間の遠心により集菌する。
4.菌体を10 mlのSolution Aに懸濁し、再度1,000×g、5分間の遠心により集菌する。
5.菌体を最終濃度がOD660=150となるようにSolution Aに懸濁する。
6.マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液100 μlを分注し、30℃1時間インキュベートする。
7.5 μgのDNA(プラスミド状態もしくは直鎖状DNA)と150 μg Carrier DNA(Total 20 μl)を加える。
  ※pAUR101の場合、プラスミドをBstP I 、EcoO65 I 、BsiW I またはStu Iで切断し、直鎖状にした後、形質転換に用いる。
8.850 μlのSolution Bを加え、静かに混合する。
9.30℃で30分間インキュベートした後、42℃で15分間熱処理する。
10.10分間室温で静置する。
11.5,000 rpm、1分間の遠心により集菌し、YPD培地 5 mlに再懸濁する。
12.30℃で6時間から一晩培養する。
13.遠心により集菌した菌体を1 ml~数 mlの0.9% NaClに懸濁し、100 μlずつをYPD選択培地にまく。30℃で培養した場合、2~4日で形質転換体が現れる。

Aureobasidin Aを用いた酵母Saccharomyces cerevisiaeの形質転換法(酢酸リチウム法)
宿主株をYPD培地(5 ml)で一晩培養
  ↓
YPD培地(50 ml/500 ml三角フラスコ)に1~1.5%植菌
  ↓
30℃でOD660=1~2(二倍体は2~4)まで振とう培養(約6時間)
  ↓
集菌後、Solution A 10 mlで洗浄し、再び集菌
  ↓
菌体をOD660=150となるように、Solution Aに懸濁
  ↓
1.5 mlマイクロチューブに100 μlずつ分注し、30℃で1時間インキュベート
  ↓
5 μg DNA(plasmid or linear)と150 μg Carrier DNA(Total 20 μl)を添加
  ↓
850 μl Solution Bを添加し、緩やかに混合
  ↓
30℃で30分間インキュベート
  ↓
42℃で15分間、熱処理
  ↓
室温で10分間静置後、5,000 rpm ×1分間で集菌
  ↓
YPD培地5~10 mlに懸濁し、30℃で6時間~overnight(O/N)培養
  ↓
集菌し洗浄後、生理食塩水(1~5 ml)に懸濁
  ↓
Aureobasidin Aを含むYPD選択プレートに100 μlずつ塗布
  ↓
30℃で培養、2~4日でAureobasidin A耐性クローンが生育

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