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Protocols

MEGALABEL™

交換反応による標識

反応液組成
エッペンドルフチューブ内で以下の反応液を調製し、全量を25 μlとする。
5'-Phosphorylated DNA fragments in TE Buffer
(≦5 pmol 5'末端)
14 μl
5×Exchange Reaction Buffer5 μl
〔γ-32P〕ATP(370 MBq/ml、10 mCi/ml)5 μl
T4 Polynucleotide Kinase(10 U/μl)1 μl
操作手順
  1. 37℃で30分間保温する。
  2. 70℃で5~10分間加熱して、酵素を失活させる。
  3. 10 μlの7 M酢酸アンモニウムを加える。
  4. 87.5 μl(2.5倍量)の冷エタノールを加え、-20℃で30~60分間保冷する。
  5. 遠心分離して沈殿を回収し、チューブの2/3容の70%冷エタノールで2回洗浄後、脱気乾燥する。
  6. 適当なバッファーに溶解する。
操作上の注意
  • 3. ~6. の操作で未反応の〔γ-32P〕ATPはほぼ除去されるが、さらに完全に除く必要のあるときは、エタノール沈殿後に、ゲルろ過等の適当なカラムを用いて精製する。
  • フェノール抽出で除タンパクをする場合は、2. ~6. の操作の後で行う。
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