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Protocols

MEGALABEL™

合成DNA(プライマー、リンカー)の標識(高標識 probeの作製)

反応液組成
エッペンドルフチューブ内で以下の反応液を調製し、全量を10 μlとする。
5'-OH合成DNA(5~10 pmol) 3 μl
10×Phosphorylation Buffer 1 μl
〔γ-32P〕ATP(222 TBq/mmol、370 MBq/ml) 5 μl
T4 Polynucleotide Kinase(10 U/μl) 1 μl
操作手順
1. 37℃で30分間保温する。
以下の操作は、交換反応による標識の操作手順2. ~6. と同じである。
※未反応の〔γ-32P〕ATPを完全に除く必要がある場合は、エタノール沈殿の代わりに以下の操作を行う。
2. 70℃で5~10分間加熱して、酵素を失活させる。
3. 10 mM Tris-HCl(pH7.5)、0.3 M NaCl、1 mM EDTAで平衡化したDE52カラム(100~200 μl)を用意する。
4. 5 μgのキャリアDNAを加え、容量を100 μlにした2. の溶液をカラムにチャージする。
5. 平衡化バッファーでカラムをよく洗った後(通常カラム容量の5倍量以上)10 mM Tris-HCl (pH7.5)、2 M NaCl、1 mM EDTAで溶出する。
6. 500 μlずつ分画し、ピーク画分を集める。
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