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Protocols

3'-Full RACE Core Set

Standard Protocol
 (3'-Full RACE Core Set)

■ 操作手順
  1. 逆転写反応
      最終濃度
    10×RNA PCR Buffer2 μl
    MgCl2(25 mM)4 μl5 mM
    dNTP Mixture(10 mM)2 μl1 mM
    AMV Reverse Transcriptase XL(5 U/μl)1 μl0.25 U/μl
    RNase Inhibitor(40 U/μl)0.5 μl1 U/μl
    Oligo dT-3sites Adaptor Primer(2.5 μM)1 μl0.125 μM
    Positive Control RNA or Experimental sample* 1 μl(2×105 copies or ≦ 1 μg total RNA )
    RNase Free dH2O 8.5 μl 
    Total 20 μl 
    Experimental sampleは発現量の少ないRNAの場合、9.5 μlまで反応系に持ちこむことができる。

    1. PCR用チューブに反応液を混和後、ミネラルオイル50~100 μlを重層する。
    2. 調製済みのチューブをサーマルサイクラーにセットし、右のプログラムで反応を行う。
      30℃10 min1 cycle
      50℃15~30 min
      95℃5 min
      5℃5 min
  2. PCR反応
    PCR反応にはTaKaRa Taq(製品コード R001A)、TaKaRa Ex Taq(製品コード RR001A)、またはPremix TaqEX Taq Version)、Premix Taq EX Taq Version)(製品コード RR003A)、One Shot LA PCR Mix(製品コード RR004)、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1(製品コード RR013A/B)を使用する。通常、TaKaRa Taqを用いた反応で充分だが、目的とするターゲットの鎖長が長い場合や、高い増幅効率を望む場合は、TaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2.1あるいはOne Shot LA PCR Mixを使用する。
    1. 下記に示す反応液を調製する。
      TaKaRa Taqの場合 注:TaKaRa Taqを用いる場合はPCR反応の際にdNTP Mixtureを新たに加える必要はない。
        最終濃度
      TaKaRa Taq添付 10×PCR Buffer8 μl0.8×
      MgCl2(25 mM)6 μl2.5 mM
      TaKaRa Taq(5 U/μl)0.5 μl0.025 U/μl
      上流PCRプライマー(20 μM)   
      (Control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer)1 μl0.2 μM
      3sites Adaptor Primer(20μM)1 μl0.2 μM
      A. の逆転写反応液20 μl 
      滅菌精製水63.5 μl 
      Total 100 μl 

      TaKaRa Ex Taq or TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1の場合>
        最終濃度
      10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)or10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)* 10 μl
      dNTP Mixture(各2.5 mM)**16 μl0.6 mM
      TaKaRa Ex Taq or TaKaRa LA Taq(各5 U/μl)0.5 μl0.025 U/μl
      上流PCRプライマー(20 μM)   
      (Control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer)1 μl0.2 μM
      3sites Adaptor Primer(20 μM)1 μl0.2 μM
      前頁A. の逆転写反応液20 μl 
      滅菌精製水51.5 μl 
      Total 100 μl 
      * 10×Ex Taq Buffer、10×LA PCR Buffer II(Mg2+plus)はそれぞれTaKaRa Ex Taq(製品コード RR001A/ B/C)、TaKaRa LA PCR Kit Ver.2.1(製品コード RR013A/B)に添付。
      ** dNTP Mixture(各2.5 mM)はTaKaRa Ex Taq(製品コード RR001A/B/C)に添付している。TaKaRa LA Taq(製品コード RR002A)を使用する場合は、dNTP Mixture(各2.5 mM)(製品コード 4030)を別途ご購入ください。

      Premix TaqTaKaRa Taq VersionまたはEx Taq Version)、またはOne Shot LA PCR Mixの場合>
        最終濃度
      One Shot LA PCR Mix(0.2 ml PCR用チューブ分注済) 25 μl 
      上流PCRプライマー(20 μM)1 μl0.2 μM
      3sites Adaptor Primer(20μM)
      (Positive control RNAの場合、Control F-1-3sites Adaptor Primer)
      1 μl0.2 μM
      前頁A. の逆転写反応液10 μl 
      滅菌精製水13 μl 
      Total 50 μl 
    2. マイクロ遠心機で約10秒間遠心した後、ミネラルオイル50~100 μlを重層する。
      (TaKaRa Thermal Cycler MP、PERSONALの場合は不要)
    3. 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで増幅させる。
      PCR条件
      94℃30 sec30 cycles
      55℃30 sec
      72℃2 min
    4. 反応終了後、反応液の一部(5~10 μl)をアガロース電気泳動を行い、反応産物を確認する。
      PCR増幅産物は、解析するまで凍結保存しておく。
      Positive Control RNAを用いた場合の増幅断片は約1.1 kbpになる。
    ■ PCR条件について
    • Annealing温度
      コントロールRNAの場合、55℃で行っているが、実際のサンプルは条件が変わるので、37~65℃の範囲で至適温度を調べる必要がある。
    • Extension time
      Extension time は、ターゲットのシークエンスの長さに影響される。通常、TaKaRa Taq、TaKaRa Ex Taqは、70~80℃で1分間に2,000~4,000 basesの割合でextensionを行う。
    • Cycle数
      cDNA量が少ない場合は、40~50 cycles行う必要がある。
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