TaKaRa LA PCR™ Kit Ver.2.1

Control反応

本キットには、コントロールとしてHT29由来ゲノムDNA、およびその約17.5 kbp領域を増幅するためのプライマーが含まれている。

1.	下記に示す反応液を調製する。 使用量 終濃度 10×LA PCR Buffer II（Mg2+ plus） 5 μl ［1×］ dNTP Mixture 8 μl 各400 μM Control Primer LA3 1 μl 0.2 μM Control Primer LA4 1 μl 0.2 μM TaKaRa LA Taq 0.5 μl 2.5 U/50 μl Control Template 2 μl 200 ng/50 μl 滅菌精製水 32.5 μl Total 50 μl
2.	サンプルの蒸発を防ぐために、ミネラルオイル* 50 μlまたはAmpli Wax PCR Gem** 1個で反応液を覆う。（TaKaRa PCR Thermal Cycler MP またはPERSONALの場合は不要）
*	反応後にミネラルオイルを完全に除く必要がある場合は、クロロホルム100 μlで抽出する。
**	Ampli Wax PCR Gemを用いると、クロロホルムで抽出する必要がない。また、Hot Start法を自動化することができる。
3.	サーマルサイクラーに反応チューブをセットする。
4.	以下の条件でPCRを行う。 98℃ 20 sec.* 30 cycles 68℃ 15 min.
*	TaKaRa PCR Thermal Cycler MP、PERSONALを使用する場合には、下記の条件でPCRを行う。 ミネラルオイルまたはPCR用Waxは必要ない。 98℃ 10 sec. 30 cycles 68℃ 15 min.
5.	反応後、反応液の一部（5～10 μl）をアガロースゲル電気泳動にかけ、反応産物を確認する。Control Primer LAの場合、約17.5 kbpのバンドが確認される。

本キットにはコントロールとしてHT29由来ゲノムDNA、およびその約1,255 bpの領域（GC含量65％）を増幅するためのプライマーが含まれている。

1.	下記に示す反応液を調製する。 使用量 終濃度 2×GC Buffer Iまたは2×GC Buffer II 25 μl ［1×］ dNTP Mixture 8 μl 各400μM Control Primer GC1 1 μl 0.2 μM Control Primer GC2 1 μl 0.2 μM TaKaRa LA Taq 0.5 μl 2.5 U/50 μl Control Template 1 μl 100 ng/50 μl 滅菌精製水 13.5 μl Total 50 μl
2.	A.LA編に同じ
3.	A.LA編に同じ
4.	以下の条件でPCRを行う。 （Thermal Cycler TP2000、TP480、MP、PERSONALとも） 94℃ 1 min 　 94℃ 30 sec. 30 cycles 60℃ 30 sec. 72℃ 2 min. 72℃ 5 min.
5.	反応後、反応液の一部（5～10 μl）をアガロースゲル電気泳動にかけ、反応産物を確認する。Control Primer GCの場合、1,255 bpのバンドが確認される。

● 推奨DNA使用量
ヒトゲノムDNA　　　　　　0.1～ 1 μg
大腸菌ゲノムDNA　　　　　10 ～100 ng
λファージDNA　　　　　　0.5～ 2.5 ng
● 長鎖DNAを増幅する場合の反応液量は、10～50 μlが望ましい。50 μl以上での反応では、増幅効率が下がる場合がある。
● 長鎖DNAを増幅する場合のプライマーは、特異性の高いものを設計する。特異性を高めるために30～35 merのプライマーが効果的である。
● 鋳型DNAはなるべく精製度の高いものを使用する必要がある。また、長鎖DNAを増幅する場合の鋳型DNA量は、通常のPCRの際の4～5倍量を使用する。
● キットの内容物は室温～37℃で完全に溶解した後、ピペッティングあるいはチューブを上下することによりよく撹拌する。vortexの使用はなるべく避ける。10 × LA PCR Buffer（または2×GC Buffer）、TaKaRa LA Taqを撹拌する場合は、泡立ちあるいは酵素の失活を防ぐために特に注意深く、ゆっくりとピペッティングする。また、各内容物は使用するまで氷上で保存する。
● 反応液は、反応開始前にピペッティングにより軽く撹拌する。この際、vortexは絶対に使用してはいけない。
● サンプルDNA中にプロテアーゼのコンタミネーションの可能性のある場合は、最初の熱変性ステップ（denaturation step）の後でTaKaRa LA Taqを加える。プロテアーゼは熱失活し、TaKaRa LA Taqの分解を防ぐことができる。