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Protocols

E. coli JM109 Competent Cells

E. coli Competent Cells

Protocol 1
プラスミドベクターを用いた形質転換
  1. コンピテントセルを使用直前に、氷中で融解する。
  2. 融解したら、おだやかに混和して均一にし、100 μlのコンピテントセルを14 ml丸底チューブ(Falconラウンドチューブ等)に移す(ボルテックスは用いない)。
  3. 形質転換するDNAを加える(10 ng以下が望ましい)。
  4. 氷中に30分間放置する。
  5. 42℃で45秒間インキュベートする。
  6. 氷中1~2分間放置する。
  7. あらかじめ37℃に保温しておいたSOC Mediumを最終1 mlになるよう加える。
  8. 37℃で1時間振とうする(160~225 rpm)。
  9. プレートに適当量をまく。
  10. 37℃で一晩培養する。

Protocol 2
M13ファージベクターDNAを用いた形質導入
(E. coli JM109、CJ236、BMH71- 18 mutS、MV1184)

  1. プラスミドベクターの形質転換の1. ~8. までの操作を行う。
  2. 3 mlのYT-soft agar(46~48℃に保温)に、200 μlの宿主菌(A600 = 0.8~1.0)を加える。
  3. 1. の適当量を2. のagarに混和し、すばやくYT-プレート上に広げる。
  4. プレートを室温で10~15分間置いた後、37℃で一晩インキュベートする。

Note
使用上の注意
  • コンピテントセルは必要本数だけを取り出し、運搬時は、ドライアイス/エタノールに入れる。
  • 14 ml 丸底チューブ (BD 社 Code. 352059 または352057)の他、1.5 ml マイクロ遠心チューブを用いても形質転換は可能だが、効率が若干悪くなることがある。
  • 100 μlのコンピテントセルを用いる場合、形質転換に使用するDNAの量を、高純度なもので10 ng以下にしないと、効率は悪くなる。
  • スケール(コンピテントセルの量等)を変えたり、他のチューブを用いたりする場合には、最適の条件を選ぶ(例えば、マイクロチューブを用いるときは42℃で60秒間インキュベートする)。
  • 回復培養はSOC Mediumの他、L-brothや Ψb-brothでもかまわないが、若干効率が悪くなることがある。
    • L-broth(1 Lあたり)
      10 gBacto tryptone
      5 gBacto yeast extract
      5 gNaCl
       1 N NaOHでpH7.5前後に調整し、オートクレーブする。
    • Ψb-broth(1 Lあたり)
      5 g Bacto yeast extract
      20 gBacto tryptone
      5 gMgSO4・7H2O
       1 N KOHでpH7.5前後に調整し、オートクレーブする。
  • 希釈が必要な場合は、7. で加えた培地で行う。
  • 宿主菌は、コンピテントセルから培養することができる。
  • YT-soft agar(100 mlあたり)
    0.8 gBacto tryptone
    0.5 gBacto yeast extract
    0.5 gNaCl
     1 N NaOHでpH7.6前後に調整し、0.6%になるようagarを添加しオートクレーブする。
  • YT-プレート(1 Lあたり)
    8 gBacto tryptone
    5 gBacto yeast extract
    5 gNaCl
     1 N NaOHでpH7.5前後に調整し、1.5%になるようagarを添加し オートクレーブする。
  • 一度融解したコンピテントセルを再度凍結保存することはお勧めしない。やむを得ず行う場合、ドライアイス/エタノール中で凍結させ、-80℃で保存する。ただし、形質転換効率は1 オーダー以上低下する可能性がある。
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