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Protocols

pAUR112 DNA

簡便な酢酸リチウム法(one-step transformation method)による酵母の形質転換

Aureobasidin A(製品コード 630466)


キット以外に必要な試薬

SD培地
(サブローデキストロース培地)
1% Polypeptone S、2% D-glucose
YPD 培地 1%Yeast extract、2% Polypeptone、2% D-glucose
YPD 寒天培地 YPD培地に2%の寒天を加える。
選択培地 ≧ 0.5 μg/ml Aureobasidin Aを含むYPD寒天培地。
* 使用する宿主株によってAureobasidin Aに対する感受性が若干異なる。

Aureobasidin A ストック溶液 500 μg/mlとなるようにエタノールまたはメタノールに溶解。
4℃保存(長期保存可)。
Carrier DNA サケ精子DNA(10 mg/ml)を超音波処理で切断(3 kbp~15 kbp)後、10分間、100℃処理し急冷後、使用する。
One-step buffer 2 M Lithium acetate(pH5.0)、50% Polyethylene glycol 3350(Sigma)、1 M Dithiothreitolを使用直前に1:8:1に混合して使用
TE buffer 10 mM Tris-HCl(pH7.0)、1 mM EDTA
操作手順

宿主株をSD培地またはYPD培地(5 ml)で一晩培養する
 ↓
15 OD660ユニット相当分(5×107~1×108 cells)を集菌する
 ↓
TE bufferで洗浄、集菌する
 ↓
菌体にOne-step buffer 100 μlとDNA 15 μlを添加する(plasmid DNA 5 μg+carrier DNA 100 μg)
 ↓
Vortexで手早く混ぜる
 ↓
45℃で30分間インキュベートする
 ↓
室温に5~8分間静置する
 ↓
5,000 rpm×1分間遠心して集菌する
 ↓
YPD培地5~10 mlに懸濁し、30℃で一晩培養する
 ↓
集菌・洗浄後、生理食塩水に懸濁する
 ↓
Aureobasidin Aを含むYPD選択プレートに100 μlずつ塗布する
 ↓
30℃で培養する
2~4日でAureobasidin A耐性クローンが生育する

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