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pAUR316 DNA

プロトプラスト-PEG法によるA. nidulansの形質転換

pAUR316 DNA(製品コード 3605)

1) 100 mlのPD培地にA. nidulansの胞子懸濁液(0.5 ml)を植菌し、30℃で12~20時間振盪培養する(バッフル付き三角フラスコ等で激しく振盪する)。
2) ガラスろ過器(3G1)でろ過して菌糸を集める。滅菌水で洗浄後、スパーテル等で押さえて菌糸から水分を十分に除く。
3) 適当量(数百μl相当)の菌糸を50 mlポリプロピレン製遠心管中の10 mlのプロトプラスト化溶液に加えて懸濁する(加える菌糸の量は、溶液中で菌糸がサラサラ動く程度)。
4) 30℃で1~2時間ゆるやかに振盪し、プロトプラスト化する(顕微鏡で確認する)。
5) ガラスろ過器(3G2)でろ過し、そのろ液を2,000 rpmで5分間遠心してプロトプラストを集める。
6) プロトプラストを0.8 M NaClで2回洗浄する。
7) プロトプラストを2×108/mlとなるようにSolution 1に懸濁し、0.2容量のSolution 2を加えて緩やかに懸濁する(Solution 2は粘性が高いので、十分に懸濁する)。
8) 0.2 mlのプロトプラスト懸濁液(10 ml以上のポリプロピレン製遠心管に入れる)にプラスミド(20 μl以下)を加える(プラスミドは最大20 μgまでにする)。
9) 氷中で10分間静置する。
10) 1 mlのSolution 2を加え、緩やかに懸濁する。
11) 室温で10~15分間静置する。
12) 10 mlのSolution 1を加え、緩やかに懸濁する。
13) 遠心してプロトプラストを集める。上清をできるだけ除き、プロトプラストを0.2 mlのSolution 1に懸濁する。
14) SD選択プレートにプロトプラスト懸濁液をのせ、5 ml(90 mmφシャーレ当たり)のSD軟寒天選択培地を加え、プロトプラストが均一に分散するようにすばやく重層する。
15) 30℃で5~7日間培養する。
注)器具および溶液はすべて滅菌し、操作は無菌的に行う。





・胞子懸濁液:

スラント上のA. nidulansの胞子を5 mlの0.1% Tween80、0.8% NaClに懸濁し、ガラスろ過器(3G1)または綿でろ過し、ろ液(胞子懸濁液)を集める。


・PD培地(1 L当たり):

Potato dextrose broth(Difco)24 g


・SD選択培地(1 L当たり):

Polypepton S(和光純薬) 10 g
glucose  20 g
NaCl  0.8 M(終濃度)
agar  20 g
Aureobasidin A*  ≧2 μg/ml(終濃度)

* 0.5 mg/mlのエタノール溶液を、オートクレーブした上記培地に適量加える。


・SD軟寒天選択培地:

SD選択培地のagarを1%にしたもの。約45℃で保温しておく。


・プロトプラスト化溶液:

3 mg/ml Yatalase(製品コード T017)
0.3 mg/ml Lysing enzymes from Trichoderma harziaum(Sigma)
0.8 M NaCl
10 mM Na Phosphate buffer(pH6.0)
調製後、ろ過滅菌して使用する。


・Solution 1:

0.8 M NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl(pH8.0)


・Solution 2:

40%(w/v)PEG4000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl(pH8.0), ろ過滅菌する。

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