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Protocols

Klenow Fragment (Large Fragment E. coli DNA Polymerase I)

5'突出末端の末端平滑化反応(fill-in 反応)

操作手順
  1. 以下の反応液を調製する。
    DNA 1 μg
    10×Klenow Buffer*1 2.5 μl
    2.5 mM dNTP Mixture 2 μl (final 0.2 mM)
    Klenow Fragment*2 0.1 U
    滅菌蒸留水 25 μlにfill up

    *1:Klenow Fragment(製品コード 2140A/B)に添付
        (100 mM Tris-HCl(pH7.5),70 mM MgCl2,1 mM DTT)
    *2:1× Klenow Bufferで希釈する。
  2. 37℃で10~30分間反応する。
  3. 70℃、10分間で酵素を熱失活する。必要があれば、フェノール処理後、エタノール沈殿を行って次のステップにすすむ。
[注意]
Klenow Fragmentは、3'-exonuclease活性を持っているので、1 μgあたり1U以上用いると、むしろ修復効果が低下します。37℃反応の場合、1 μgDNAあたり0.1U程度使用するようにしてください。
3'-exonuclease活性は低温では阻害されるので、低い温度で長時間(10℃で1時間あるいは0℃で3時間)反応させる方法も効果的です。この場合、Klenow Fragmentは1 μg DNA あたり3Uまで使用できます。
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