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Protocols

TRACP & ALP double-stain Kit

TRACP&ALP double-stain Kitの使用方法

キットにはそれぞれの酵素のプレミックス基質が10 ml用×3本(錠)含まれている。これら3本(錠)分で24穴培養プレート約5枚分の染色が可能である。
また、二重染色を実施する場合、必ず酸性ホスファターゼ活性を先に検出し、その後にアルカリ性ホスファターゼ基質に置き換えて染色を行うこと。これを逆に行うと、酸性ホスファターゼの一部が失活するので注意すること。

■細胞の固定
  (A)24穴プレートで培養した細胞をサンプルとする場合(骨髄細胞を固定する場合を例として以下に示す)

  1. 24穴プレート内で細胞を培養する。

  2. 培養上清を取り除き、滅菌PBSで1回洗浄する。

  3. 細胞固定液(Fixiation solution)*を各ウェルに250 μlずつ加えて室温で5分間放置し、細胞をウェルに固定する。

  4. 滅菌水を各ウェルに約2 ml加えて固定液を希釈し、それから液を吸い出す。再び滅菌水を約2 ml加えてウェルを洗浄し、最終的に液を取り除く。サンプルはこの段階からは乾燥してもよく、-20℃以下で1週間程度であれば、そのまま保管できる。

  *:添付の固定液(30ml)で24穴プレート5枚分の固定が可能です。

  (B)96穴プレートで培養した細胞をサンプルとする場合

24穴プレートの場合と基本的に操作は同じであるが、使用する1ウェルあたりの試薬の量を変える。細胞固定液*の量は1ウェルあたり50 μl、洗浄に用いる滅菌水の量は250 μlが適当である。
*:添付の固定液(30ml)で96穴プレート5枚分の固定が可能です。

■活性染色

酸性ホスファターゼ基質液またはアルカリ性ホスファターゼ基質液(錠剤を精製水に溶かして調製)を、固定した細胞に加える。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を検出する場合は、酸性ホスファターゼ基質液10 mlに対し、添付の0.5 M酒石酸ナトリウム緩衝液を1 ml加えておく。添加する基質液の量は、24穴プレートの場合は250 μl/ウェル、96穴プレートの場合は 50 μl/ウェルを目安とする。スライドガラスの場合は適当量を固定した細胞上に添加したのち、乾燥しないようにパラフィルムで覆う。
発色時間は、細胞中に存在するホスファターゼ活性の量により左右されるが、通常、37℃の条件で15分~45分程度で染色される。
活性二重染色をする場合は、酸性ホスファターゼの染色を終了した後、反応液を除き、滅菌水で洗浄してからアルカリ性ホスファターゼ基質を加えて再び染色を行う。発色時間は細胞中のアルカリ性ホスファターゼ活性の量により左右されるが、通常、37℃の条件で15分~45分程度で染色される。
反応液を取り除き、滅菌水で3回洗浄して反応を止める。核染色を実施しない場合は、この時点で乾燥を防ぐためにグリセロール溶液などを加えた後検鏡する。

注意 活性染色後にさらにメチルグリーンで核染色をすると、活性染色結果が見えにくくなる場合があるので、メチルグリーンを使用する前に必ず一度検鏡してから実施すること。

■核染色

活性染色終了後、メチルグリーンを細胞をおおう程度に加えて室温で5分間染色し、次に純水で洗浄する。乾燥を防ぐためにグリセロール溶液などを加えてから検鏡する。

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