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Protocols

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>

【5】λファージベクターに外来DNAを挿入する場合

DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(製品コード 6023)
(1) λファージベクター〔250 ng (10 fmol)〕およびインサートDNA (30~100 fmol) を含むDNA溶液を用意する。
(2) (1)のDNA溶液の2倍容量のLigation Mix (5~10 μl) を添加して、よく混合する。
(3) 26℃で 5~ 10 分間*1反応する。
(4) in vitro packagingを行う。*2

*1 反応温度は、16℃よりも26℃の方が高い効率が得られます。反応時間を長くしてもかえって効率が落ちる場合がありますので、反応は短時間(5~10分間)で行ってください。
*2 DNA Ligation Kit溶液は、反応後そのままパッケージングに用いることができます。市販の Packaging Kit〔MaxPlax Lambda Packaging Extracts (EPICENTRE Technologies社)、GigaPack (Agilent Technologies社) など〕を使用しても、パッケージングに用いるDNA Ligation Kitの溶液量が packaging lysateに対して10%以下(容量比)の場合は、DNA Ligation Kit溶液の組成がパッケージングを阻害することはありません。通常、1回のパッケージングに、DNA Ligation Kit溶液 4 μlまで用いることができます。反応溶液をすべてパッケージングに用いる場合は、DNAを一度エタノール沈殿した後、packaging lysateに対して10%以下(容量比)のTEバッファーに溶解してお使いください。

DNA Ligation Kit <Mighty Mix>を使用してパッケージングを行う場合の注意
DNA Ligation Kit <Mighty Mix>を使用した場合の効率は、DNA Ligation Kit Ver.1を使用した場合の効率とほぼ同じになります。<Mighty Mix>の場合、反応液の容量がもとのDNA 溶液の3倍になりますが、Ver.1の場合、もとのDNA溶液の2倍です。パッケージングに用いることができる溶液量には*2のような制限があります。DNA Ligation Kit溶液そのままをパッケージングに用いる場合には、多くのDNA量を用いることができるので、Ver.1の使用を推奨します。
<使用例> λファージベクターを用いたin vitro packaging
EcoR I, Sal I 切断済 Uni-ZAP XR vector (Agilent Technologies社) 1 μg (1 μl) に、EcoR I, Sal I 切断pBR322 DNA 400 ngを加えたDNA溶液 (3.3 μl) をプロトコールに従って、Total 10 μlで26℃、10分間反応を行った。ライゲーション反応液10 μl中2.5μlを使用してGigaPack III Gold (Agilent Technologies社)およびMaxPlax Lambda Packaging Extracts (EPICENTRE Technologies社) を用いてパッケージングを行い、プラークを形成させた。


パッケージング試薬プラーク数/μg
Uni-ZAP Vector
DNA Ligation Kit <Mighty Mix>GigaPack III2.6×106
MaxPlax5.5×106
DNA Ligation Kit Ver.1GigaPack III6.0×106
MaxPlax9.2×106
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