Reverse Transcriptase XL (AMV)

Reverse Transcriptase XL (AMV)を用いたcDNA合成反応例

操作手順

1.以下の反応液を調製する。
Total RNA*1
(またはpolyA RNA)
5~10 μg
(1~2μg)
Oligo dT Primer
またはRamdom Primer
0.5~1 μg
0.5 μg
Reverse Transcriptase XL (AMV) Buffer*22.5 μl
2.5mM dNTP Mixture2 μl (final 0.2mM)
RNase Inhibitor25 U
Reverse Transcriptase XL (AMV)25 U
滅菌精製水 25 μlにfill up

2.42℃*3で30~60分間反応する。

3. 氷中に移し、冷却する。

*1:二次構造が強い鋳型RNAを用いる場合は、反応の前にRNA溶液を65℃で5分加熱後、氷中で急冷する操作を加えることにより、二次構造の影響を緩和することができる。
*2:Reverse Transcriptase XL(AMV)(製品コード 2620A/B)に添付
( 250 mM Tris-HCl(pH8.3),50 mM MgCl2,20 mM DTT, 500 mM KCl)
*3:Reverse Transcriptase XL(AMV)は60℃でも逆転写酵素反応を行うことが可能である。ただし、高温で反応性が悪い場合は、42℃付近で反応する。
プライマーにRandom Primerを用いる場合は、Random PrimerとサンプルRNAが42℃で十分アニーリングできるような長さになるまで伸長するように、あらかじめ30℃で10分間逆転写反応を行う。

  Reverse Transcriptase XL (AMV)