One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

Thermal Cycler Dice Real Time Systemシリーズを用いる場合の操作方法

1. 下記に示す反応液を 氷上で調製する。

<1反応あたり>
試薬使用量最終濃度
2×One Step TB Green RT-PCR Buffer III12.5 μl
TaKaRa Ex Taq HS (5 U /μl)0.5 μl
PrimeScript RT enzyme Mix II0.5 μl
PCR Forward Primer (10 μM)0.5 μl0.2 μM*1
PCR Reverse Primer (10 μM)0.5 μl0.2 μM*1
total RNA2 μl*2
RNase Free dH2O8.5 μl
Total25 μl
*1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。
*2 total RNA 10 pg~100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

2. 反応チューブまたはプレートを遠心機で軽く遠心後、Thermal Cycler Dice Real Time System シリーズにセットし、反応を開始する。

反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。
プロトコル

Pattern 1:逆転写反応
  Hold
  42℃5分
  95℃10秒
Pattern 2:PCR反応
  Cycle:40
  95℃5秒
  60℃30秒
Pattern 3:Dissociation

※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。

3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。

解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time Systemの取扱説明書をご参照ください。

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