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Protocols

PrimeSTAR® Mutagenesis Basal Kit

プライマー設計について

変異導入に用いるプライマーは、図A~Cに示すように目的とする変異を導入した配列を想定し、その部位を含む形で設計する。まず変異部位を中心にしてオーバーラップ領域を15塩基選定し、次に変異部分から3'側に18塩基伸ばしたものをプライマー配列として選択する。置換欠失挿入のいずれの場合もプライマー設計法は同じである。置換および挿入は1~15塩基の範囲で可能である。欠失の場合、サイズに制限はない。
また、本法は形質転換にライゲーション反応を必要としないので、プライマーのリン酸化は不要である。

◆プライマー設計上の注意
変異導入プライマーの5'側15塩基のオーバーラップ配列のGC含量が75%を超えると、PCR効率が低下し、変異体が得られない場合がある。その場合には、プライマー設計あるいはPCR条件の検討が必要である。
また、変異導入プライマーの5'側15塩基のオーバーラップ配列全長がリピート配列の場合、リピート単位の欠失、挿入が起こる場合がある。
なお、PCRで増幅しない配列を含むプラスミドに本法は利用できない。

 図A
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 図B
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 図C
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