この画面を閉じる

Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

Applied Biosystems 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

One Step TB Green™ PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)(製品コード RR086A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を氷上で調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 410 μl25 μl
    PrimeScript 1step Enzyme Mix 20.8 μl2 μl 
    PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μl2 μl0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μl2 μl0.4 μM*1
    ROX Reference Dye or Dye II(50×)*30.4 μl1 μl 
    total RNA 2 μl  4 μl*2 
    RNase Free dH2O5.2 μl14 μl 
    Total20 μl*4  50 μl*4 

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 50 μl反応液あたりtotal RNA 20 pg~200 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

    *3 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度が低く設定されています。7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析する場合には、ROX Reference Dye II (50×)の使用を推奨します。
    StepOnePlusおよび7300 Real-Time PCR Systemには、ROX Reference Dye (50×)を使用してください。

    *4 各装置の推奨容量に従って調整する。

  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。

    <Applied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>


    プログラム
    Stage 1,2 :逆転写反応
        Reps:1
        42℃ 5分
        95℃ 10秒

      Stage 3:PCR反応
        Reps:40
        95℃  5秒
        60℃ 30~34秒*

    Stage 4: Dissociation Protocol
    * StepOnePlusでは30秒に、7300では31秒に、7500では34秒に設定する。

    <Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System>

    Holding Stage
      42℃  5分
      95℃  10秒
    Cycling Stage
      Number of Cycles:40
      95℃  3秒
      60℃  30秒
    Melt Curve Stage

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、 (5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃10秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、各リアルタイムPCR装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について

シャトルPCR
ステップ温度時間検出コメント
変性95℃3~5秒OFFリアルタイムPCRの増幅サイズは一般的に300 bp以下なので、95℃で3~5秒程度でよい。
アニーリング
/伸長
60~66℃20~30秒
(30~34秒)*1
ONまずは、説明書に記載した各装置での推奨条件を試す。反応条件の至適化を行う場合には、60~66℃の範囲で検討する。反応性が悪いときは、このステップの時間を延ばすか 3ステップPCRに変更するとよい。
3ステップPCR
ステップ温度時間検出コメント
変性95℃3~5秒OFFリアルタイムPCRの増幅サイズは一般的に300 bp以下なので、95℃で3~5秒程度でよい。
アニーリング55~60℃10~20秒OFFまずは55℃、10秒の条件を試す。
非特異的産物が生じる場合や増幅効率が悪い場合は、アニーリング温度の至適化により改善する場合がある。アニーリング時間を長くすると、増幅効率が良くなる場合がある。
伸長72℃6~15秒
(30~34秒)*1
ON増幅サイズが 300 bp以下の場合、6~15秒の範囲で検討する必要がある(伸長反応の時間が長すぎると、非特異的増幅が起こる場合がある)。

サイクル数:30~45サイクル

* Applied Biosystemsの装置では、検出ステップを30秒以上に設定する必要があります。7700では30秒に、7000および7300は31秒に、7500は34秒に設定します。
この画面を閉じる