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Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)

LightCyclerを用いる場合の操作方法

One Step TB Green™ PrimeScript™ RT-PCR Kit II (Perfect Real Time)(製品コード RR086A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を氷上で調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 410 μl
    PrimeScript 1step Enzyme Mix 20.8 μl 
    PCR Forward Primer(10μM) 0.8 μl0.4 μM*1
    PCR Reverse Primer(10μM)0.8 μl0.4 μM*1
    total RNA 2 μl      *2
    RNase Free dH2O5.6 μl 
    Total20 μl 

    *1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.2~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 total RNA 10 pg~100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。

  2. PCRキャピラリーを遠心機で軽く遠心後、LightCyclerにセットし、反応を開始する。
    反応は、下記のシャトルPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Tm値が低めのプライマーなど、シャトルPCRでの反応が難しい場合には、3ステップPCRを行います。

    プロトコル
    Stage 1:逆転写反応
     42℃ 5分 20℃/秒
     95℃ 10秒 20℃/秒
     1サイクル

    Stage 2:PCR反応
     95℃ 5秒 20℃/秒
      60℃ 20秒 20℃/秒
     40サイクル

    Stage 3:融解曲線分析
     95℃ 0秒 20℃/秒
     65℃ 15秒 20℃/秒
     95℃ 0秒 0.1℃/秒

    Stage2:PCR反応

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃、(5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃10秒で充分です。


  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、LightCyclerの取扱説明書をご参照ください。

PCR反応条件について

シャトルPCR
ステップ温度時間検出コメント
変性95℃3~5秒OFFリアルタイムPCRの増幅サイズは一般的に300 bp以下なので、95℃で3~5秒程度でよい。
アニーリング
/伸長
60~66℃20~30秒
(30~34秒)
ONまずは、説明書に記載した各装置での推奨条件を試す。反応条件の至適化を行う場合には、60~66℃の範囲で検討する。反応性が悪いときは、このステップの時間を延ばすか3ステップPCRに変更するとよい。
3ステップPCR
ステップ温度時間検出コメント
変性95℃3~5秒OFFリアルタイムPCRの増幅サイズは一般的に300 bp以下なので、95℃で3~5秒程度でよい。
アニーリング55~60℃10~20秒OFFまずは55℃、10秒の条件を試す。
非特異的産物が生じる場合や増幅効率が悪い場合は、アニーリング温度の至適化により改善する場合がある。アニーリング時間を長くすると、増幅効率が良くなる場合がある。
伸長72℃6~15秒
(30~34秒)
ON増幅サイズが 300 bp以下の場合、6~15秒の範囲で検討する必要がある(伸長反応の時間が長すぎると、非特異的増幅が起こる場合がある)。

サイクル数:30~45サイクル
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