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Protocols

PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase

PrimeSTAR® GXL DNA Polymeraseの標準プロトコール

● 反応液組成
使用量
最終濃度
5×PrimeSTAR GXL Buffer10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)4 μl200 μM each
primer 110~15 pmol0.2~0.3 μM*
primer 210~15 pmol0.2~0.3 μM*
Template下記参照
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase1 μl1.25 U/50 μl
滅菌精製水up to 50 μl


* 10 kb以上の長鎖を増幅する場合、final conc. 0.2 μMで反応してください。

【推奨鋳型量】
(長鎖増幅の場合)
ヒトゲノムDNA5~500 ng(100~500 ng)
大腸菌ゲノムDNA100 pg~200 ng(10~200 ng)
プラスミドDNA10 pg~10 ng(1~10 ng)
cDNA25~750 ng(250~750 ng)
● PCR条件
【増幅鎖長が≦10 kbの場合】
98℃10 sec.
 
30 cycles
55℃ or 60℃*115 sec.
68℃*21min. / kb
  または
98℃10 sec.
 
30 cycles
68℃1 min./kb

*1 Tm値(下記の式※で計算)が55℃を超える場合はアニーリング温度を60℃に、Tm値が55℃以下の場合はアニーリング温度を55℃に設定してください。
 ※ Tm値(℃)=[(A、Tの数)×2]+[(G、Cの数)×4]-5
*2 3 step PCRの場合も、伸長温度は68℃に設定してください。

【増幅鎖長が10 kb~30 kbの場合】
98℃10 sec.
 
30 cycles
68℃10 min.

【増幅鎖長が>30 kbの場合】
98℃10 sec.
 
30 cycles
68℃15 min.

◆ PCR条件の選択
・増幅鎖長が10 kb以下の場合はまず3 step PCRをお試しください。スメアや非特異的増幅が見られる場合はアニーリング温度を上げるか、2 step PCRをお試しください。
・GCリッチな鋳型や10 kb以上の長鎖の増幅には、2 step PCRを推奨します。
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