1ステップRT-PCRの操作
PrimeScript™ II High Fidelity RT-PCR Kit（製品コード R023A）
本キットはプロトコールを一部変更することで1ステップRt-PCRにも利用できる。
ここでは1ステップR-PCRの操作方法を紹介する。
ここでは1ステップR-PCRの操作方法を紹介する。
- 下記に示す反応液を調製する。
*1 Positive Control RNAの場合、F-1 Primer試薬 使用量 最終濃度 5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μl 1× dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl 200 μMPrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl PrimeSTAR GXL for RT-PCR 2 μl 上流 Primer（20 μM）*1（センス） 1 μl 0.4 μM 下流 Primer（20 μM）*2（アンチセンス） 1 μl 0.4 μM Template RNA *3 RNase Free dH2O up to 50 μl
*2 Positive Control RNAの場合、R-1 Primer
*3 total RNAの場合は10 ～ 1000 ngの使用を推奨。
なお、Positive Control RNAの場合は 1 μlを使用してください。
- 調製したチューブをサーマルサイクラーにセットし、至適プログラムで RT- PCR を行う。
一般的な反応条件
45℃*4 30 min. 94℃ 2 min. ↓ 98℃ 10sec. 30 cycles または 98℃ 10sec. 30 cycles 60 or 55℃*5 15 sec. 68℃ 1 min./kb 68℃ 1 min./kb
Positive Control RNA の場合 コントロール反応では、462 bpが検出される。45℃ 30 min. 94℃ 2 min. ↓ 98℃ 10 sec. 30 cycles 60℃ 15 sec. 68℃ 1 min.
*4 逆転写反応温度
PrimeScript II RTase（ PrimeScript II RT Enzyme Mix に含まれる ）は、プライミングの特異性が向上しているため、特異性が要求される下流プライマーからの逆転写反応をRNAの分解や酵素の失活の心配のない45℃で反応することができます。
*5 アニーリング温度
プライマーのTm値（下記の式で計算）が55℃をこえる場合
→ 60℃に設定
12プライマーのTm値（下記の式で計算）が55℃以下の場合
→ 55℃に設定
※ Tm値計算方法
Tm値（℃）＝ ［（A、Tの数）×2］＋［（G、Cの数）×4］－5
PCR 条件の選択
・ まず3ステップPCRをお試しください。
・ GCリッチな鋳型の増幅には、2ステップPCRを推奨します。
上記の設定で良好な結果が得られない場合は、以下の方法で検討してください。
＜ スメア、エキストラバンドが生じる場合 ＞
（1）アニーリング温度を63℃まで2℃ずつ上げてみる。
（2）2ステップPCRにする。
（3）プライマーのTm値が50℃以下の場合、アニーリング温度を50～55℃で試す。
＜ 目的産物が増幅しない（少ない）場合 ＞
（1）鋳型量を推奨条件にあわせる。
（2）PCRサイクル数を40～50サイクルに増やして反応を行う。
（3）アニーリング温度を2℃ずつ下げてみる。
● PrimeSTAR GXL for RT-PCRでは、dTTPの代わりにdUTPを使用することはできません（著しく反応性が低下します）。また、イノシンを含むプライマーの使用は避けてください。
