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Protocols

毒素原性大腸菌 (STp gene) One Shot PCR Kit

検出プロトコール
毒素原性大腸菌 (STp gene) One Shot PCR Kit(製品コード RR108A)

A. サンプルの調製例
  1. 菌体熱抽出サンプルの調製-I
    1) 増菌培養液4 μlを1.5 ml tube、または2 μlを0.2 ml PCR tubeに採る。
    2) 滅菌精製水を1.5 ml tubeの場合は196 μl、0.2 ml tubeの場合は98 μl加えて混合する。
    3) 95℃で5分間処理する。(0.2 ml PCR tubeの場合はTaKaRa PCR Thermal Cyclerを利用すると簡便に行うことができる。)
    4) 遠心分離(12,000 rpm、4℃、10分)し、上清を回収する。これを熱抽出サンプルとする。

    さらに感度を上げたい場合は、次の2. の調製方法をお試しください。
  2. 菌体熱抽出液の調製方法-II
    増菌培養液

    1 mlをサンプリング(1.5 ml tube)

    遠心分離(5,000 rpm、4℃、5分)

    沈殿物(菌体など)
                  │←滅菌精製水 100 μl

    懸濁

    熱処理(95℃、5分)

    遠心分離(12,000 rpm、4℃、5分)

    上清を熱抽出サンプルとして回収

    25 μlをPCR反応へ

* この方法で調製した熱抽出サンプルを用いてPCRを行ったときに反応が阻害されるようであれば、以下の [ 1 ] あるいは [ 2 ] (または [ 1 ] と [ 2 ] の組み合わせ)の手法を試してください。

[ 1 ] 滅菌精製水で懸濁する前の沈殿物(菌体など)をPBSで2~3回洗浄する。
(PBS 500 μlで懸濁 → 遠心 → 上清を捨てる を、2~3回繰り返す)
[ 2 ] 調製した熱抽出サンプルの10倍希釈液、100倍希釈液(希釈は滅菌精製水でよい)を調製し、その25 μlをPCR反応に用いる。
* 増菌培養液は、それぞれ適当な標準プロトコールに従って食品サンプルから調製したものを用いる。また、熱抽出サンプルは-20℃で保存可能である。
B. PCR反応
反応液調製・反応条件
正しい検出結果を得るためにNegative control反応を行ってください。
1)2×One Shot PCR solution tubeは、調製した熱抽出サンプルを25 μl添加する。
Negative controlとして滅菌精製水を25 μl加えたものを1本用意する。
2)各チューブのキャップをしっかり閉め、サーマルサイクラーにセットしてPCR反応を開始する。
【PCR条件】
94℃ 2 min. 
94℃ 30 sec.
 
 40 cycles
55℃ 1 min.
72℃ 1 min.

* 反応は約3時間で終了する。反応後のサンプルは4℃、または-20℃で保存可能である。
C. 判定
サンプル中にヒト型耐熱性エンテロトキシン遺伝子(STp gene)が存在すれば、123 bpの増幅産物(バンド)が検出される。インターナルコントロールは、689 bpの増幅産物が検出される。
サンプル反応の結果は、Negative control反応結果と照らし合わせて判定してください。
[ Negative control反応の電気泳動結果 ]

インターナルコントロール由来増幅産物(689 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(689 bp)が検出された。
STp遺伝子由来増幅産物(123 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1  【4】 コンタミネーションを起こさず、正しくPCR反応が進んだ。 【3】
STp遺伝子由来増幅産物(123 bp)が検出された。 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【2】 コンタミネーションを起こしていると考えられる。*2 【1】

[ サンプル反応の電気泳動結果 ]

インターナルコントロール由来増幅産物(689 bp)が検出されない。 インターナルコントロール由来増幅産物(689 bp)が検出された。
STp遺伝子由来増幅産物(123 bp)が検出されない。 PCR反応が正常に進まなかった。*1 【4】 STp遺伝子は検出限界以下である。 【3】
STp遺伝子由来増幅産物(123 bp)が検出された。 STp遺伝子陽性である。*3 【2】 STp遺伝子陽性である。*3 【1】

【1】~【4】は、下図のレーンをご参照ください。

*1 何らかの原因でPCR 反応が正常に行われていない可能性が高いので再反応を行う。
*2 コンタミネーションを起こしていると考えられる。反応液調製場所及び使用した機器を除染したうえですべてのサンプルで再度反応を行う。
*3 Negative control反応の結果が正しい結果が得られた場合にSTp遺伝子陽性と判定される。



※ 100 bp弱の位置に非特異的バンドがみられることがありますが、非特異的増幅によるものなので判定には関係ありません。
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