この画面を閉じる

Protocols

TB Green® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

Applied Biosystems 7500/7500 Fast Real-Time PCR SystemおよびStepOnePlus Real-Time PCR Systemを用いる場合の操作方法

TB Green Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)(製品コード RR071A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量使用量最終濃度
    TB Green Premix Ex Taq GC (2×)10 μl25 μl
    PCR Forward Primer (10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer (10 μM)0.4 μl1 μl0.2 μM*1
    ROX Reference Dye (50×) or Dye II (50×)*20.4 μl1 μl
    template2 μl4 μl*3
    滅菌精製水6.8 μl18 μl 
    Total20 μl*450 μl*4 

    *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度を低く設定している。7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析を行う場合には、ROX Reference Dye II (50×)を使用する。
    StepOnePlusには、ROX Reference Dye (50×)を使用する。

    *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。 20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。

    *4 各装置の推奨容量に従って調製する。



  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。PCR条件を至適化する場合は、「PCR条件について」を参照してください。

    <Applide Biosystems 7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus>

    シャトルPCR標準プロトコール
    シャトルPCR標準プロトコール

      Stage 1 :初期変性
        Reps:1
        95℃ 30秒

      Stage 2 :PCR反応
    Reps:40
    95℃  5秒
    60℃ 30or34秒*

      Stage 3 :Melt Curve

    * StepOnePlusでは30秒に、7500では34秒に設定する。

    <Applide Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System>

    シャトルPCR標準プロトコール
    シャトルPCR標準プロトコール

      Stage 1 :Holding Stage
      Number of Cycles:1
        95℃ 30秒

      Stage 2 :Cycling Stage
      Number of Cycles:40
        95℃ 10秒
        60℃ 30秒

      Melt Curve Stage

    ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5~)15分の活性化ステップは行わないで下さい。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

  3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

PCR条件について

【PCR条件の検討】
○反応特異性を上げるには
アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら、検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃5秒(10秒)
 
60℃30秒

アニーリング温度を上げる

95℃5秒(10秒)
 
~64℃30秒

○増幅効率を上げるには
伸長時間を延ばすか、3 step PCRに変更することにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃5秒(10秒)
 
60℃30秒

伸長時間を延ばす

95℃5秒(10秒)
 
60℃1分~

[3 step PCR]
95℃5秒(10秒)
 
55℃30秒
72℃30秒

伸長時間を延ばす
95℃5秒(10秒)
 
55℃30秒
72℃1分~
【初期変性】
初期変性は通常95℃、30秒で十分である。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でも、ほとんどの場合、この条件で良好に反応できる。鋳型の状態によっては95℃、1~2分程度に延長することが可能であるが、時間が長すぎると酵素の失活を招く恐れがあるので、2分以上の条件は推奨しない。
この画面を閉じる