TB Green^® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   ＜1反応あたり＞
   

   試薬	使用量	使用量	最終濃度
   TB Green Premix Ex Taq GC (2×)	10 μl	25 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   ROX Reference Dye (50×) or Dye II (50×)*2	0.4 μl	1 μl	1×
   template	2 μl	4 μl	*3
   滅菌精製水	6.8 μl	18 μl
   Total	20 μl*4	50 μl*4

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 ROX Reference Dye II (50×)は、ROX Reference Dye (50×)より濃度を低く設定している。7500/7500 Fast Real-Time PCR Systemで解析を行う場合には、ROX Reference Dye II (50×)を使用する。
   StepOnePlusには、ROX Reference Dye (50×)を使用する。

   *3 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。 20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。

   *4 各装置の推奨容量に従って調製する。




2. 反応を開始する。
   PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。PCR条件を至適化する場合は、「PCR条件について」を参照してください。
   

   ＜Applide Biosystems 7500 Real-Time PCR System、StepOnePlus＞

   

   シャトルPCR標準プロトコール
   
   　　Stage 1 ：初期変性
   　　　　Reps：1
   　　　　95℃　30秒
   
   　　Stage 2 ：PCR反応

   Reps：40
   95℃　 5秒
   60℃　30or34秒^*

   
   　　Stage 3 ：Melt Curve
   
   * StepOnePlusでは30秒に、7500では34秒に設定する。
   
   

   ＜Applide Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System＞

   

   シャトルPCR標準プロトコール
   
   　　Stage 1 ：Holding Stage
   　　Number of Cycles：1
   　　　　95℃　30秒
   
   　　Stage 2 ：Cycling Stage
   　　Number of Cycles：40
   　　　　95℃　10秒
   　　　　60℃　30秒
   
   　　Melt Curve Stage
   
   

   ※使用上の注意
   本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5～)15分の活性化ステップは行わないで下さい。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
   PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

PCR条件について