この画面を閉じる

Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

Smart Cycler II System を用いる場合の操作方法

One Step TB Green™ PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time) (製品コード RR096A/B)

1. 下記に示す反応液を氷上で調製する。

<1反応あたり>
試薬使用量最終濃度
2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 412.5 μl
TaKaRa Ex Taq HS Mix1.5 μl 
PrimeScript PLUS RTase Mix0.5 μl 
PCR Forward Primer(10 μM) 1.0 μl0.4 μM *1
PCR Reverse Primer(10 μM)1.0 μl0.4 μM *1
total RNA2.0 μl*2
RNase Free dH2O6.5 μl 
Total25 μl 

*1 最終primer濃度は0.4 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

*2 total RNA 10 pg~100 ngをtemplateとして使用することが望ましい。


2. 反応を開始する。

反応チューブをSmart Cycler専用遠心機で軽く遠心後、Smart Cyclerにセットし、反応を開始する。*

* 反応は、下記の3ステップPCRの標準プロトコールで行うことをお勧めします。まずは、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。Smart Cycler System/Smart Cycler II Systemを用いた場合は、シャトルPCRでは反応性が低下する場合があります。


プログラム
Stage 1:逆転写反応
Hold 
42℃5分
95℃10秒
Stage 2:PCR反応
Cycle:40
95℃5秒
55℃30秒
72℃30秒
Stage 3:Melt Curve


※使用上の注意
本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HS はポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃ (5~)15分の活性化ステップは行わないでください。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
PCR反応前に逆転写酵素の熱失活を行うには、通常95℃ 10秒で充分です。


3. 反応終了後、解析を行う。

反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。*
* 解析方法は、Smart Cycler System取扱説明書を参照してください。
この画面を閉じる