この画面を閉じる

Protocols

One Step TB Green® PrimeScript™ PLUS RT-PCR Kit (Perfect Real Time)

実験条件の選び方(製品コード RR096A/B)

推奨条件で良好な反応性が得られない場合には、下記の要領でプライマー濃度やPCR条件の検討を行う。また反応系によっては、特性が異なる他のリアルタイムRT-PCR試薬を用いることにより、反応性が大きく改善することもある。
実験条件を選ぶ際には、反応特異性と増幅効率の両方を考慮して総合的に判断する。両方のバランスが取れた実験系では広い濃度範囲で正確な定量が可能になる。

  • 反応特異性が高い実験系
    ・No Template Controlでプライマーダイマーなどの非特異的増幅が生じない。
    ・目的産物以外の非特異的増幅が生じない。
  • 増幅効率が高い実験系
    ・増幅産物がより早いサイクルで検出される(Ct値が小さい)。
    ・PCR増幅効率が高い(理論値である100%に近い)。

【プライマー濃度の検討】
プライマー濃度と反応特異性および増幅効率の間には、以下のような関係がある。反応特異性を上げるにはプライマー濃度を下げ、増幅効率を上げるにはプライマー濃度を上げる。

(プライマー濃度)低濃度(0.1 μM)高濃度(1.0 μM)
反応特異性高い矢印低い
増幅効率低い高い

【PCR条件の検討】
  • 反応特異性を上げるには
    アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら検討を行う。
[ 2 step PCR ]
標準プロトコール

95℃ 5秒
60℃ 30秒

アニーリング温度を上げる

95℃ 5秒
~64℃ 30秒

  • 増幅効率を上げるには
    伸長反応時間を延ばすか3 step PCRに変更することにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討を行う。
[ 2 step PCR ]
標準プロトコール

95℃ 5秒
60℃ 30秒

伸長時間を延ばす

95℃ 5秒
60℃ 1分~

[ 3 step PCR ]

95℃ 5秒
55℃ 30秒
72℃ 30秒

伸長時間を延ばす

95℃ 5秒
55℃ 30秒
72℃ 1分~

【各種リアルタイムRT-PCR試薬について】
タカラバイオでは、インターカレーター法の1ステップリアルタイムRT-PCR試薬と2ステップリアルタイムRT-PCR 試薬を各種販売している。高感度検出および多検体の解析には1ステップリアルタイムRT-PCRが適しているが、多遺伝子の解析には2ステップリアルタイムRT-PCRの方が便利な場合もある。また、2ステップリアルタイムRT-PCRでは、より特異性の高い反応が可能である。それぞれ実験目的に応じて使い分ける。なお1ステップリアルタイムRT-PCR試薬としては、本製品の他に、増幅効率の高いOne Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(製品コード RR066A/B)を販売している。本製品で十分な増幅効率が得られない場合はこちらを検討してみる。
この画面を閉じる