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Protocols

TB Green® Premix Ex Taq™ GC (Perfect Real Time)

Thermal Cycler Dice® Real Time Systemシリーズを用いる場合の操作方法

TB Green Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)(製品コード RR071A/B)
  1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
    <1反応あたり>
    試薬使用量最終濃度
    TB Green Premix Ex Taq GC(2×)12.5 μl
    PCR Forward Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM*1
    PCR Reverse Primer(10 μM)0.5 μl0.2 μM*1
    template(<100 ng)2 μl*2
    滅菌精製水9.5 μl 
    Total25 μl*3 

    *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1~1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

    *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA(RT反応液)をtemplateとして添加する場合は、添加量をPCR反応液容量の10%以下とする。

    *3 反応液量は25 μlを推奨。

  2. 反応を開始する。
    PCR反応は、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めします。
    まずはこのプロトコールで試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
    PCR条件を至適化する場合は、下記の「PCR反応条件について」を参照してください。

    シャトルPCR標準プロトコール
    シャトルPCR標準プロトコール
      Hold(初期変性)
        Cycle:1
        95℃ 30秒
      2 step PCR
        Cycle:40
        95℃  5秒
        60℃  30秒
      Dissociation
  3. ※使用上の注意
    本製品に使用しているTaKaRa Ex Taq HSはポリメラーゼ活性を抑制する抗Taq抗体を利用したホットスタートPCR用酵素です。他社の化学修飾タイプのホットスタートPCR酵素で必要なPCR反応前の95℃(5~)15分の活性化ステップは行わないで下さい。必要以上の熱処理を加えると酵素活性が低下し、増幅効率、定量精度に影響を及ぼす傾向があります。
    PCR反応前に鋳型の初期変性を行う場合でも、通常95℃ 30秒で充分です。

  4. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
    解析方法は、各装置の取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について

【PCR条件の検討】
○反応特異性を上げるには
アニーリング温度を上げると反応特異性が改善することがある。増幅効率とのバランスを確認しながら、検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃5秒
 
60℃30秒

アニーリング温度を上げる

95℃5秒
 
~64℃30秒

○増幅効率を上げるには
伸長時間を延ばすか、3 step PCRに変更することにより、増幅効率が改善することがある。以下の手順で検討してください。
[シャトルPCR]
標準プロトコール

95℃5秒
 
60℃30秒

伸長時間を延ばす

95℃5秒
 
60℃1分~

[3 step PCR]
95℃5秒
 
55℃30秒
72℃30秒

伸長時間を延ばす
95℃5秒
 
55℃30秒
72℃1分~
【初期変性】
初期変性は通常95℃、30秒で十分である。環状プラスミドやゲノムDNAなど変性しにくい鋳型でも、ほとんどの場合、この条件で良好に反応できる。鋳型の状態によっては95℃、1~2分程度に延長することが可能であるが、時間が長すぎると酵素の失活を招く恐れがあるので、2分以上の条件は推奨しない。
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