MightyAmp™ for Real Time (TB Green^® Plus)

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   

   <1反応あたり>

   試薬	使用量	最終濃度
   MightyAmp for Real Time (TB Green Plus)（2×）	12.5 μl	1×
   PCR Forward Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer（10 μM）	0.5 μl	0.2 μM*1
   template（<100 ng）	2 μl	*2
   滅菌水	9.5 μl
   Total	25 μl*3

   *1 最終primer濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題がある時は0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。DNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA（RT反応液）をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液容量の10％以下になるようにする。

   *3 反応液量は25 μlを推奨。

2. 反応を開始する。
   PCR反応は、下記の標準プロトコールで行うことをお勧めします。
   まずはこのプロトコールで試し、必要に応じてPCR条件を至適化してください。
   PCR条件を至適化する場合は、下記の「PCR反応条件について」を参照してください。
   
   標準プロトコール
   
   　　Hold（初期変性）
   　　　　Cycle：1
   　　　　98℃　2分
   　　3 step PCR
   　　　　Cycle：40
   　　　　98℃　 10秒
   　　　　60℃　 15秒
   　　　　68℃　 1分/kb
   （500 bp以下は30秒）
   　　Dissociation

※使用上の注意
本製品に使用しているMightyAmp DNA Polymeraseは強力なホットスタート抗体を使用しているので、必ず98℃、2分の初期変性を行い、抗体を熱変性させてください。

3. 反応終了後、増幅曲線と融解曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   解析方法は、Thermal Cycler Dice Real Time Systemの取扱説明書をご参照ください。

PCR条件について