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Protocols

PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)

逆転写反応:Probe Assayの場合

製品コード RR047A/B
1. ゲノムDNA除去反応
下記に示すゲノムDNA除去反応液を氷上で調製する。
RNAサンプル以外のコンポーネントを必要本数+α分調製し、マイクロチューブに分注後、RNAサンプルを添加するとよい。

<1反応あたり>
5×gDNA Eraser Buffer2.0 μl
gDNA Eraser1.0 μl
total RNA*1
RNase Free dH2O
Total10.0 μl
 ↓
42℃、2 min(もしくは室温5 min*2
2. 逆転写反応
下記に示す逆転写反応液を氷上で調製する。
1. の反応液以外のコンポーネントを必要本数+α分、Master mixとして調製し、1. の反応液に10 μlずつ添加する。*3
直ちに反応液を軽く攪拌して均一にした後、逆転写反応を行う。
1. の反応液10.0 μl
5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4.0 μl
Master mix
10 μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I1.0 μl
RT Primer Mix*44.0 μl
RNase Free dH2O 1.0 μl
Total 20.0 μl*5
   ↓
  37℃、15 min*6
  85℃、5 sec
  4℃*7

*120 μlの逆転写反応系で逆転写できるのは、おおよそ2 μgまでのtotal RNAです。
*2室温での反応の場合、30分程度放置しても問題ありません。
*3Master mixを調製せず、1. の反応液に個々の試薬を加えて逆転写反応液を調製する場合は、まずRNase Free dH2O と5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) を添加・混合してgDNA Eraserの活性を完全に抑制した後、RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix Iを添加してください。さらに反応液を軽く攪拌して均一にした後、逆転写反応を開始します。
*4RT Primer Mix を用いると、mRNA全長にわたり効率よくcDNA が合成されますが、別途ご用意されたOligo dT primerやGene Specific Primerを用いることも可能です。それぞれの場合の使用量は以下の通りです。
  Oligo dT primer 50 pmol/20 μl反応系
  Gene Specific Primer 5 pmol/20 μl反応系
*5逆転写反応は、必要に応じてスケールアップすることも可能です。
*6Gene Specific Primerを用いる場合、逆転写反応を42℃、15分で行ってください。
PCR で非特異的な増幅が生じた場合には、逆転写温度を50℃に変更すると改善される場合があります。
*7cDNA合成産物を長期保存する時は、-20℃以下で保存してください。

(注)逆転写反応液をリアルタイムPCRに持ち込む時は、PCR反応液容量の10%以下にしてください。
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