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Protocols

Synthetic siRNA Quantitation Kit

Synthetic siRNA Quantitation Core Kitによる合成si RNA定量操作フロー

Synthetic siRNA Quantitation Kit(製品コード 6142)
※必ず、説明書をご確認の上、操作を行ってください。

dATPを5 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり5 μlの合成siRNAサンプル(total RNA、合成siRNA希釈液など)を添加する
75℃、5分(サンプル熱変性)
氷上で急冷
【Master Mix】
<1反応あたり>
Terminal Transferase Buffer13 μl
Recombinant RNase Inhibitor1 μl
Terminal Transferase1 μl
1反応あたりMaster Mixを15 μlずつ熱変性済みサンプルに添加する
(サンプル間のコンタミネーションに気をつける)
37℃、30分(poly dA tailing反応)
4℃
Oligo dT Primerを5 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり5 μlのpoly dA tailing反応液を添加する
75℃、5分(Oligo dT Primerアニーリング)
【Master Mix】
<1反応あたり>
RT Buffer9 μl
RT Enzyme Mix1 μl
1反応あたりMaster Mixを10 μlずつアニーリング反応液に添加する
(サンプル間のコンタミネーションに気をつける)
42℃、15分(逆転写反応)
85℃、5秒(逆転写酵素を熱失活させる)
4℃
鋳型DNA
リアルタイムPCR
(Thermal Cycler Dice Real Time System使用)
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
【Master Mix】
<1反応あたり>
滅菌精製水8.5 μl
Universal Primer(10 μM)1 μl
siRNA qPCR Primer(10 μM)1 μl
TB Green Premix Ex Taq II(2×)12.5 μl
Master Mixを23 μlずつ反応チューブに分注し、1反応あたり2 μlの逆転写反応液を添加する

反応を開始する
Pattern 1: (初期変性)
  Hold   95℃、30秒
Pattern 2: PCR反応
  Cycles: 40
  95℃、5秒
  60℃、30秒
Pattern 3: Dissociation
反応終了後、解析を行う
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