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細菌からのDNA抽出プロトコール

NucleoSpin Tissue（製品コード 740952.10、740952.50、740952.250）

使用時には必ず英文説明書をご確認ください。

	細菌
1. サンプルの準備	細菌の培養液 1 mlをマイクロチューブにいれ、8,000×gで5分間遠心し、上清を除去し、細菌のペレットを用意する。
2. Proteinase K処理	Buffer T1 180 μl, Proteinase K溶液*1 25 μlを細菌のペレットに添加し、激しく攪拌する。56℃で1～3時間（または一晩）完全に溶解するまでインキュベートする。 溶解しにくい細菌の場合：グラム陽性菌など溶解しにくい細菌の場合は、溶菌酵素による前処理が必要です。 細胞のペレットを、20 mg/ml lysozyme in 20 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1% Triton X-100（pH8.0）（各自で用意） 180 μl に懸濁し、37℃で30～60分インキュベートする。その後、Proteinase K 25 μlを添加し、56℃で1～3時間（または一晩）完全に溶解するまでインキュベートする。 （Option） RNase処理を行う場合：Proteinase K処理後、RNase A（20 mg/ml）溶液（各自で用意）*2 20μlを加え、室温で5分インキュベートする。
3. サンプルの溶解	サンプルを撹拌する。Buffer B3*3 200 μlを加えて、激しく撹拌した後、70℃で10分間インキュベートする。 不溶物が残る場合は、11,000×g、5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。
4. エタノールの添加	96～100%エタノール 210 μlを添加し、よく混合する。
5. カラムへの吸着	NucleoSpin Tissue ColumnをCollection Tubeにセットする。 4の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。 ろ液を捨て、新しいCollection Tubeにカラムをセットする。
6. メンブレンの洗浄	1回目の洗浄 Buffer BW　500 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、Collection Tubeにカラムをセットする。 2回目の洗浄 Buffer B5*4　600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。 ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
7. メンブレンの乾燥	カラムを、11,000×gで1分間遠心する。
8. DNAの溶出	カラムをマイクロチューブ（1.5 ml：各自で用意）にセットする。 70℃に温めたBuffer BE*5 100 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。 溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、－20℃で保存する。（凍結融解はできるだけ繰り返さない） *5 Buffer BEの組成：5 mM Tris-HCl、pH8.5

*1	Proteinase K溶液の調製法 製品コード 740952.10の場合：Proteinase K（凍結乾燥品）6 mgのチューブにProteinase Buffer PB 260 μlを加えて完全に溶解する。 調製したProteinase K溶液は、－20℃で保存する。(6ヵ月安定)
*2	RNase A溶液（製品コード 740505.50、50 mg）の調製法 RNase A 1 vialにRNase free H2O 2.5 mlを加え溶解して、RNase A溶液（20 mg/ml）を調製する。 調製したRNase A溶液は、3ヵ月までは4℃で保存可能。長期の保存の場合は、小分けして－20℃で保存する。
*3	Lot.1210/***以前のロットの場合、Buffer B3は各自で調製する。 Buffer B3の調製法 Buffer B1を全量Buffer B2のボトルに移し、よく混合する。混合後、ボトルにLysis Buffer B3のラベルを貼る。
*4	Buffer B5の調製法 製品コード 740952.10の場合：Wash Buffer B5（concentrate）6 mlに、エタノール（96～100%）24 mlを添加する。

  NucleoSpin^® Tissue