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Protocols

NucleoSpin® Tissue

細菌からのDNA抽出プロトコール

NucleoSpin Tissue(製品コード 740952.10、740952.50、740952.250)
使用時には必ず英文説明書をご確認ください。
 細菌
1. サンプルの準備

細菌の培養液 1 mlをマイクロチューブにいれ、8,000×gで5分間遠心し、上清を除去し、細菌のペレットを用意する。
2. Proteinase K処理
Buffer T1 180 μl, Proteinase K溶液*1 25 μlを細菌のペレットに添加し、激しく攪拌する。56℃で1~3時間(または一晩)完全に溶解するまでインキュベートする。

溶解しにくい細菌の場合:グラム陽性菌など溶解しにくい細菌の場合は、溶菌酵素による前処理が必要です。
細胞のペレットを、20 mg/ml lysozyme in 20 mM Tris-HCl, 2mM EDTA, 1% Triton X-100(pH8.0)(各自で用意) 180 μl に懸濁し、37℃で30~60分インキュベートする。その後、Proteinase K 25 μlを添加し、56℃で1~3時間(または一晩)完全に溶解するまでインキュベートする。

(Option) RNase処理を行う場合:Proteinase K処理後、RNase A(20 mg/ml)溶液(各自で用意)*2 20μlを加え、室温で5分インキュベートする。
3. サンプルの溶解
サンプルを撹拌する。Buffer B3*3 200 μlを加えて、激しく撹拌した後、70℃で10分間インキュベートする。
不溶物が残る場合は、11,000×g、5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。
4. エタノールの添加
96~100%エタノール 210 μlを添加し、よく混合する。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin Tissue ColumnをCollection Tubeにセットする。
4の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨て、新しいCollection Tubeにカラムをセットする。
6. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer BW 500 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、Collection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer B5*4 600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
7. メンブレンの乾燥

カラムを、11,000×gで1分間遠心する。
8. DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
70℃に温めたBuffer BE*5 100 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、-20℃で保存する。(凍結融解はできるだけ繰り返さない)
*5 Buffer BEの組成:5 mM Tris-HCl、pH8.5

*1 Proteinase K溶液の調製法
製品コード 740952.10の場合:Proteinase K(凍結乾燥品)6 mgのチューブにProteinase Buffer PB 260 μlを加えて完全に溶解する。
調製したProteinase K溶液は、-20℃で保存する。(6ヵ月安定)
*2 RNase A溶液(製品コード 740505.50、50 mg)の調製法
RNase A 1 vialにRNase free H2O 2.5 mlを加え溶解して、RNase A溶液(20 mg/ml)を調製する。
調製したRNase A溶液は、3ヵ月までは4℃で保存可能。長期の保存の場合は、小分けして-20℃で保存する。
*3 Lot.1210/***以前のロットの場合、Buffer B3は各自で調製する。
Buffer B3の調製法
Buffer B1を全量Buffer B2のボトルに移し、よく混合する。混合後、ボトルにLysis Buffer B3のラベルを貼る。
*4 Buffer B5の調製法
製品コード 740952.10の場合:Wash Buffer B5(concentrate)6 mlに、エタノール(96~100%)24 mlを添加する。
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