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Protocols

NucleoBond® Xtra Midi/Maxi

NucleoBond Finalizerを用いたプラスミド精製プロトコール(低コピープラスミド用)

NucleoBond Xtra Midi Plus(製品コード 740412.10、740412.50)
*低コピープラスミドの精製には、使用するバッファー量を増やす必要があるため、追加バッファーが必要です。NucleoBond Xtra Buffer Set I(製品コード 740417)をご利用ください。

1培養液の調製
集菌
培養液のOD600を測定し、培養液の推奨液量を求める。
 培養液の液量(V)=800/ OD600 (ml)
培養液を、4℃、4,500~6,000×gで10分間以上遠心し、上清を除去する。
2菌の溶解細胞ペレットを、Buffer RES(+RNase A)*1 16 mlに完全に溶解する。
Buffer LYS 16 mlを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
室温で、5分間静置する。
3カラムの平衡化
カラムフィルターを挿入したNucleoBond Xtra Columnを、Buffer EQU 12 mlで平衡化する。
図に示すように、カラムの縁に沿ってバッファーを注ぐ。液を自然落下させてカラムを空にする。
フィルター全体が湿っていることを確認する。
4中和Buffer NEU 16 mlを、2の細胞懸濁液に加え、直ちに穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
5ライセートの清澄化とローディング4の溶液が入ったチューブを3回反転して沈殿が均一に懸濁している状態にした後、フィルターに加える。
液を自然落下させてカラムを空にする。
6カラムの洗浄(1回目)
Buffer EQU 5 mlでフィルターとカラムを洗浄する。
図に示すようにカラムの縁に沿ってバッファーを注ぎ、フィルターに残っている溶液を確実に洗浄する。
7カラムフィルターの廃棄
カラムからフィルターを引き抜く。あるいは、カラムを逆さにしてフィルターを除く。
8カラムの洗浄(2回目)
Wash Buffer WASH 8 mlで、カラムを洗浄する。
9溶出Elution Buffer ELU*2 5 mlでプラスミドDNAを溶出する。
溶出液を15 ml遠心チューブ(各自で用意)に集める。
10沈殿
イソプロパノール(室温)を3.5 ml加え、ボルテックスで十分混合した後、室温で2分間静置する。
NucleoBond Finalizerを用いた精製(所要時間:約5分)
11沈殿のローディング
30 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、出口にNucleoBond Finalizerを取り付ける。
沈殿混液をシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してFinalizerに通す。
流出液は廃棄する。
12沈殿の洗浄
30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerをシリンジの出口に再びとりつける。
70%エタノール2 mlをシリンジの中にいれ、プランジャーを挿入してエタノールを押しこみ、Finalizerに通す。
流出したエタノールは廃棄する。
13膜フィルターの乾燥
30 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerを再びシリンジの出口に取り付ける。
残ったエタノールを飛ばすため、プランジャーを挿入して空気を押しこみ、Finalizerに通す。
エタノールが全く出てこなくなるまで、このステップを3回以上繰り返す。
(キムタオル等の上で、Finalizerの先からエタノールが出てこないことを確認する。)
14DNAの溶出
30 mlシリンジからFinalizerを取り外す。
1 mlシリンジからプランジャーを抜き取り、Finalizerをシリンジの出口に取り付ける。
適量のBuffer TRIS(またはTE Buffer)200~800 μlをシリンジの中に加える。
Finalizerの出口を新しい回収チューブにセットし、プランジャーを挿入してプラスミドを溶出する。
1 mlシリンジからFinalizerを取り外し、プランジャーを抜き取る。
Finalizerをシリンジの出口に再び取り付ける。
最初の溶出液をシリンジに戻し、同じ回収チューブの中に再び溶出する。

*1 Buffer RES(+RNase A)の調製法
RNase A(凍結乾燥品)のチューブに1 mlのBuffer RESを加えて完全に溶解し、全量をBuffer RESのボトルに移す。
*2 BACのようなサイズの大きなプラスミドを溶出する場合は、Elution Buffer ELUを50℃に加温しておくと、回収率が上がる。
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