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Protocols

EpiScope® Nucleosome Preparation Kit

操作方法(細胞回収~Micrococcal Nuclease処理~DNA抽出)

EpiScope Nucleosome Preparation Kit(製品コード 5333)

A. 細胞回収と溶解
  1. 培養プレートから細胞を回収し、約1×106 cells/mlとなるように適当量のPBSを加えて懸濁し、1.5 mlマイクロチューブに1 mlずつ分注する。
    1反応あたり約0.5~2×106 cellsの処理を推奨。
  2. 3,000 rpm、4℃、3分間遠心し、細胞を回収する。
  3. 上清を除去し、Protease Inhibitor Cocktail 10 μlを加える。
  4. Cytoplasmic Lysis Buffer 1 mlを加え、ピペッティングにより十分に懸濁する。
  5. 氷上で10分間静置する。
  6. 5,200 rpm、4℃、10分間遠心する。遠心の間に、10×Micrococcal Nuclease Bufferを滅菌精製水で希釈して、1×Micrococcal Nuclease Buffer 100 μlを調製する。
  7. 遠心上清を除去し、遠心沈渣(細胞核を含む)に1×Micrococcal Nuclease Buffer 50 μlを添加後、ピペッティングにより十分懸濁し、細胞核懸濁液とする。
    Micrococcal Nuclease Buffer 添加後、ピペッティングを十分行い、遠心沈渣を出来る限り懸濁してください。十分懸濁を行った後も沈渣の塊が多少残る場合がありますが、これらを完全に懸濁する必要はありません。
B. Micrococcal Nuclease処理
  1. 反応数+α分のマスターミックスを室温で調製する。
    試薬1反応あたり使用量
    Micrococcal Nuclease (20 U/μl)0.2 μl
    Micrococcal Nuclease Buffer (10×)5.0 μl
    RNaseA2.0 μl
    Protease Inhibitor Cocktail (100×)1.0 μl
    滅菌精製水41.8 μl
    合計50 μl
    (注)氷上で調製すると塩が析出するため、必ず室温で調製してください。
    ・Micrococcal Nucleaseは反応開始直前に添加してください。
  2. 0.2 mlマイクロチューブにマスターミックスを50 μl分注し、A-7の細胞核懸濁液 50 μlを加えて混合する。
  3. 37℃で30分間インキュベートする(サーマルサイクラー使用)。
  4. マイクロチューブへ0.5 M EDTAを2 μl加え、反応を停止する。
  5. Proteinase Kを4 μl加え、37℃で30分間インキュベートする(サーマルサイクラー使用)。
    引き続き、「C. DNA抽出」の操作を行う。
C. DNA抽出

1.B-5で調製したProteinase K処理サンプルから、NucleoSpin Gel and PCR Clean-upを用いてDNAを抽出する。

  • Proteinase K処理サンプル106 μlにBinding Buffer NTIを212 μlを加える。
  • NucleoSpin Gel and PCR Clean-up ColumnをCollection Tube(2 ml)にセットする。
    (1)の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
    ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
  • Wash Buffer NT3(エタノール含)700 μlをカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
    ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
  • カラムを、11,000×g、2分間遠心する。
  • カラムをマクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
    Elution Buffer NE 50 μlを加え、室温で1分間インキュベートした後、11,000×g、1分間遠心する。

2.得られたDNA溶液の一部(約5 μl)を用いてアガロースゲル電気泳動を行い、DNAサイズを確認する。

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