この画面を閉じる

Protocols

NucleoSpin® Plasmid/NucleoSpin® Plasmid (NoLid)

NucleoSpin® Plasmid/NucleoSpin® Plasmid(NoLid)(製品コード 740588.10, 740588.50, 740588.250)

プラスミド精製プロトコール(高コピープラスミド)
NucleoSpin PlasmidNucleoSpin Plasmid (NoLid)
1.培養液の調製
集菌
大腸菌の培養液1~5 mlを11,000×gで30秒間遠心し、上清をできるだけ除去する。
2. 菌の溶解
細胞ペレットにBuffer A1(+ RNase A)*1250 μlを加え、ボルテックスまたはピペッテイングで完全に溶解する。
Buffer A2*2 250 μlを加え、チューブを6~8回反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
5分間またはライセートが清澄化するまで室温で静置する。
Buffer A3 300 μlを加え、チューブを6~8回反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
3. ライセートの清澄化
2の溶液を11,000×g、5分間室温で遠心する。
上清が清澄化するまでこのステップを繰り返す。
4.カラムへの吸着
NuleoSpin Plasmid QuickPure ColumnをCollection Tube (2 ml)にセットする。
3の上清を最大750 μlをカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨て、カラムを同じCollection Tubeにセットする。

残りの上清をカラムに添加し、同じ操作を繰り返す。
5.メンブレンの洗浄
Buffer B4*3 600 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、再び同じCollection Tubeにセットする。

(オプション)
プラスミドの宿主にヌクレアーゼ活性をもつ大腸菌(例:HB101など)を使用している場合、Buffer A4での洗浄ステップの前に以下のステップを追加する。

あらかじめ50℃に温めたBuffer AW 500 μlを添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、カラムを同じCollection Tubeにセットする。
6.メンブレンの乾燥
11,000×gで2分間遠心する。Collection Tubeからカラムをはずす。
7.DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
Buffer AE 50 μlを添加し、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。

溶出液をプラスミド溶液として保存する。

Buffer AEの組成:5 mM Tris-HCl、pH8.5


*1Buffer A1(+RNase A)の調製法
RNase A (凍結乾燥品)のチューブに1 mlのBuffer A1を加えて完全に溶解し、溶解した溶液全量をBuffer A1のボトルに移す。
RNase Aを添加したBuffer A1は、4℃で6カ月安定である。
*2Buffer A2に沈殿が生じている場合は、30~40℃で数分温めて沈殿を完全に溶解ししてください。
溶解後、Buffer A2を室温(18~25℃)に戻してから使用してください。
*3Buffer A4 の調製
Wash Buffer A4(concentrate)に、4倍量のエタノール(96~100%)を添加する。
この画面を閉じる