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Protocols

NucleoSpin® Tissue XS

動物組織・培養細胞からのDNA抽出プロトコール

NucleoSpin Tissue XS (製品コード740901.10, 740901.50, 740901.250)
 動物組織細胞
1サンプルの準備2.5 mg*1の組織を用意する。液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、またはホモジナイザーによる処理などで細分化処理を行う。105個の培養細胞をBuffer T1 80 μlに懸濁する。
2Proteinase K処理
Buffer T1 80 μl, Proteinase K*2 8 μlを組織に添加し、vortex(5秒間×2)を行う。56℃で1~4時間(または一晩)インキュベートする。
(Option)RNase処理を行う場合:Proteinase K処理後、RNase A(20 mg/ml)溶液(各自で用意)*3 20 μlを加え、室温で5分インキュベートする。
Proteinase K 8 μlを組織に添加し、vortex(5秒間×2)を行う。56℃で10分間インキュベートする。
(Option)RNase処理を行う場合:Proteinase K*2処理後、RNase A(20 mg/ml)溶液(各自で用意)*3 20 μlを加え、室温で5分インキュベートする。
3サンプルの溶解
サンプルを攪拌する。Buffer B3 80 μlを加えて、vortex(5秒間×2)を行った後、70℃で5分間インキュベートする。
室温までクールダウンする。
不溶物が残る場合は、11,000×g, 5分間遠心し、上清を新しいチューブに移す。
4エタノールの添加
96~100%エタノール 80 μlを添加し、よく混合する。
5カラムへの吸着
NucleoSpin Tissue XS Column(緑のリング)をCollection Tube(2 ml)にセットする。
4の溶液をカラムに添加し、11,000×g, 1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、新しいCollection Tube(2 ml)にカラムをセットする。
6メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer B5*4 50 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
2回目の洗浄
Buffer B5*4 50 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心する。
ろ液とCollection Tubeを捨てる。
7DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml: 各自で用意)にセットする。
Buffer BE* 20 μlをメンブレンの中央に加え、11,000×gで1分間遠心する。
溶出したDNA溶液は、4℃、長期保存の場合は、-20℃で保存する。(凍結融解はできるだけ繰り返さない)
Buffer BEの組成 : 5 mM Tris-HCl, pH 8.5
8 残存エタノールの除去
(オプション)
チューブの蓋をあけたまま、溶出液を90℃、8分で加熱する。

*1組織の量が2.5~10 mgの場合は、ステップ2.3.4で使用するBuffer T1, Buffer B3, エタノールの量を160 μlにして使用する。
*2Proteinase K溶液の調製法
製品コード 740902.10の場合:Proteinase K(凍結乾燥品)6 mgのチューブにProteinase Buffer PB 260 μlを加えて完全に溶解する。
調製したProteinase K溶液は、-20℃で保存する。(6ヵ月安定)
*3RNase A溶液(製品コード 740505.50、50 mg)の調製法
RNase A 1 vialにRNase free H2O 2.5 mlを加え溶解して、RNase A溶液(20 mg/ml)を調製する。
調製したRNase A溶液は、3ヵ月までは4℃で保存可能。長期の保存の場合は、小分けして-20℃で保存する。
*4 Buffer B5の調製法
製品コード 740902.10の場合:Wash Buffer B5(concentrate)4 mlに、エタノール(96~100%)16 mlを添加する。
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