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Protocols

Multiplex PCR Assay Kit Ver.2

マルチプレックスPCRの基本条件

Multiplex PCR Assay Kit Ver.2(製品コード RR062A/B)
【反応組成】
2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)25 μl
Primer mix*1適宜
Multiplex PCR Enzyme Mix0.25 μl
template DNA適宜
dH2Oup to 50 μl
*1各プライマーは、通常それぞれが最終濃度0.2 μMとなるように添加する。
反応によっては使用量を変化させることで結果が改善されることがある。
プライマーのTm値が55℃以上になるように設定する。
(Tm値は下記のTm近似計算式で計算)
  Tm値=4×(G、Cの数)+2×(A、Tの数)+35-2×(総塩基数)
注)Nearest Neighbor法を用いたTm値を利用する場合は、プライマーのTm値が60℃より高くなるように設定する。
【 PCR条件 】
 <プライマー数10ペア以下、増幅鎖長2 kbまでの場合>
94℃  60 sec.
94℃ 30 sec.
25~40 cycles
57~60℃ 30~60 sec.
72℃ 30~60 sec.
72℃ 10 min.

 <プライマー数10ペアを超える場合>
94℃ 60 sec.
94℃ 30 sec.
15~30 cycles
60℃ 1~10 min.*2
72℃ 10 min.
*2伸長時間は、使用するプライマーの数や反応性により異なる。
プライマー200ペア使用した場合、4分を目安に設定する。
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