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Protocols

NucleoSpin® totalRNA FFPE

FFPEサンプルからのRNA抽出方法

NucleoSpin totalRNA FFPE(製品コード 740982.10、740982.50、740982.250)
試薬の準備
  rDNase溶液*1,Buffer MW2*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
Buffer MLFに沈殿が生じていないことを確認する*3
1.サンプルの準備
 ホルマリン固定パラフィン包埋切片*4を用意し、1.5 mlのマイクロチューブ(各自で用意)に入れる。
2. 脱パラフィン処理
1 mlのParaffin Dissolverを添加し、56℃で5分保温する。
すぐにVortexで激しく混合し、パラフィンを完全に溶解する。
16,000×gで2分間遠心する。
Buffer MLF*3 170 μlを添加する。絶対に混合しない。そのまま16,000×gで2分間遠心し、Paraffin Dissolver(上層)をピペットで取り除く。
3. サンプルの溶解
Method 3A
15 μlのProteinase Kを添加し、ピペッティングなどで緩やかに混合する。
56℃で15分間保温する*5
Buffer MKA 15 μlを添加し、素早く混合する。
氷上で5分間静置した後、16,000×gで5分間遠心する。上清を別の1.5 mlマイクロチューブ(各自で用意)へ移し、80℃で正確に15分間保温する。(脱クロスリンク)
Method 3B
15 μlのProteinase Kを添加し、ピペッティングなどで緩やかに混合する。
56℃で90分間保温する*5
Buffer MKA 15 μlを添加し、素早く混合する。
氷上で5分間静置した後、16,000×gで5分間遠心し、上清を別の1.5 mlマイクロチューブ(各自で用意)へ移す。



4. Bufferの添加
Buffer MX 500 μlを添加し、vortexで5秒間×2回混合する。
室温で1分間静置する。
5. カラムへの吸着
NucleoSpin RNA ColumnをCollection Tube(2 ml)にセットする。
4の溶液をカラムに添加し、16,000×g、15秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
6. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer MW2*2 700 μlをカラムに添加し、16,000×gで15秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer MW2*2 250 μl をカラムに添加し16,000×gで1分間遠心し、メンブレンを乾燥させる。
7. DNase処理
(オプション)
rDNase溶液*1 50 μlを直接NucleoSpin RNA Columnのメンブレンに添加する。
室温で15分間保温する。
Buffer MX 100 μlをカラムに添加し、1分間室温で静置する。
16,000×gで15秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。


1回目の洗浄
Buffer MW2*2 700 μlをカラムに添加し、16,000×gで15秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer MW2*2 250 μl をカラムに添加し、16,000×gで1分間遠心しメンブレンを乾燥させる。
8. RNAの溶出
NucleoSpin RNA Columnを新しいCollection Tube(1.5 ml)にセットする。
RNase-free H2O 30~50 μlをカラムのメンブレンに加え、室温で1分間静置する。
16,000×gで1分間遠心する。
溶出したRNA溶液は、-20℃または-70℃で保存する。
*1rDNase溶液
製品コード 740982.10(10回用)の場合:rDNase 1 vialにReaction Buffer for rDNase 750 μlを加え、室温で1分間インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。
調製したrDNase溶液は小分けして、-20℃に保存する(6ヵ月間安定)。凍結融解は3回までとする。
*2Buffer MW2
製品コード 740982.10(10回用)の場合:Wash Buffer MW2(Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール24 mlを添加する。
*3 Buffer MLFは使用前に沈殿が生じていないことを確認する。白い沈殿が見られる場合は、30~40℃で数分間保温後、撹拌して沈殿を完全に溶解させること。
*4 ホルマリン固定パラフィン包埋切片は10枚(1~20 μm厚)、組織重量50 mgまで使用可能。
10 μm厚の組織切片1 cm2が約1 mgに相当する。
*5 Proteinase Kの反応時間
溶解しないサンプルが残っている場合は、サンプルが分解されるまで反応時間を延ばす。


<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。

*1 は、製品コード 740982.10(10回用)の場合の調製法です。
製品コード 740982.50(50回用)、740982.250(250回用)の場合の調製法は英文説明書をご参照ください。
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