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Protocols

NucleoSpin® Soil

土壌内の微生物のゲノムDNA精製プロトコール

NucleoSpin® Soil(製品コード 740780.10, 740780.50, 740780.250)
試薬の調製
  Buffer SW2*1が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
Buffer SL1, Buffer SL2に沈殿が生じていないことを確認する*2
1.サンプルの準備
セラミックビーズ入りのNucleoSpin Bead Tubeにサンプル250~500 mgを加える。決して1 mlのマークを超えてサンプルを加えないこと。
Buffer SL1またはBuffer SL2を700 μl加える。*3 *4
2. サンプル溶解条件の調整
Enhancer SXを150 μl添加する*5
3. サンプルの溶解
NucleoSpin Bead Tubeを水平に倒して、vortexで室温5分間、最高速度で激しく混合する。
他の破砕装置を使用する場合には、装置のマニュアルに従う。
4. 混入物の沈殿
NucleoSpin Bead Tubeを11 ,000×g、2分間遠心して生じた泡を取り除く(ここで泡を取り除いた上清を別の1.5 ml tubeに移して以下の作業を行ってもよい)。
Buffer SL3を150 μl加えて、vortexで5秒間混合する。
氷上で5分間静置する。
11,000×g、1分間遠心する。


5. 溶解液のろ過
NucleoSpin Inhibitor Removal Column(赤色リング)をCollection Tube(2 ml:蓋付)にセットする。
4の上清700 μlをカラムに加え、11,000×g、1分間遠心してろ液を回収する。
サンプルの水分含量が多く、4の上清が700 μlを超える場合にはNucleoSpin Inhibitor Removal Columnを別のマイクロチューブ(各自で用意)にセットし、残りの上清をカラムに加えて11,000×g、1分間遠心し、ろ液を回収して、1回目のろ液と混合する。
ろ液に沈殿が見られる場合は上清を別のマイクロチューブ(各自で用意)に移す。
6. Bufferの添加
5のろ液にBuffer SB 250 μlを添加し、vortexで5秒間混合する。
7. カラムへの吸着
NucleoSpin Soil Column(緑色リング)をCollection Tube(2 ml:蓋なし)にセットする。
6の溶液550 μlをカラムに加えて、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
6の溶液の残りをカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
8. メンブレンの洗浄
1回目の洗浄
Buffer SB 500 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
2回目の洗浄
Buffer SW1、550 μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
3回目の洗浄
Buffer SW2、700 μlをカラムに添加し、vortexで2秒間撹拌する。
11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
4回目の洗浄
Buffer SW2、700 μlをカラムに添加し、vortexで2秒間撹拌する。その後、11,000×gで30秒間遠心する。
ろ液を捨てた後、同じCollection Tubeにカラムをセットする。
9. メンブレンの乾燥
8のカラムをさらに11,000×gで2分間遠心する。カラムをCollection Tubeのろ液に触れないよう取り出す。
10. DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
Buffer SE 30~100 μlを添加し、蓋 を閉めずに室温で1分間インキュベートする。
蓋 を閉めて、11,000×gで30秒間遠心し、DNAを溶出させる。
*1Buffer SW2の調製法
Wash Buffer SW2(concentrate)に、4倍量のエタノール(96~100%)を添加する。
*2Buffer SL1, Buffer SL2は使用前に沈殿が生じていないことを確認する。沈殿が確認された場合は30~40℃で10分間温める。この間、2分ごとにボトルを撹拌して沈殿を完全に溶解する。
*3 使用するLysis Bufferはサンプルに応じてBuffer SL1またはBuffer SL2を選択する。経験のないサンプルの場合、両方のBufferを試すとよい。
*4 サンプルが乾燥していて吸水量が多い場合は、Lysis Buffer(Buffer SL1またはBuffer SL2)を1.5 mlの印まで追加する。
サンプルの水分が多い場合は、Lysis Bufferを加える前に必要に応じて遠心し、余分な水分を除いておく。
*5 Enhancer SXの添加によりDNA収量が向上するが、フミン酸の溶出も促進される。DNAの純度を上げたい場合やフミン酸含量が多いサンプルの場合はEnhancer SXの添加量を検討するとよい(英文説明書参照)。


<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書をご確認ください。
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