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Protocols

Human iPS Cell Generation™ Episomal Vector Mix

ヒト線維芽細胞を標的としたiPS細胞の樹立(6 well plateの場合)

Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix(製品コード 3673)
(~Day -2)線維芽細胞の拡大培養
  1. 9 mlの10% FBS/DMEM培地を15 mlチューブに分注する。
  2. 凍結線維芽細胞のバイアルを37℃の湯浴槽にて融解する。
  3. 少し氷が残るくらいで湯浴槽から引き上げ、1. の培地に融解後の細胞懸濁液を加える。
  4. 200×g、18℃で10分間遠心する。
  5. 100 mm tissue culture plateに播種し、拡大培養を行う。
  6. 細胞に添付の取扱説明書に従って培養してください。
    100 mm tissue culture plate 1枚から1~2×106個程度回収できます。


(Day 0)エレクトロポレーションによるHuman iPS Cell Generation Episomal Vector Mixの導入
  1. 15 mlチューブに10% FBS/DMEM培地を3 ml分注し、湯浴槽にて37℃で加温する。
  2. 80~90%コンフルエントになったヒト線維芽細胞の培養上清を吸引除去し、PBSを10 ml加える。
  3. PBSを吸引除去し、1 mlの0.25% Trypsin/1 mM EDTA solutionを加える。
  4. 37℃で3分間インキュベートする。
  5. 10% FBS/DMEM培地を4 ml加え、ピペッティングによりシングルセルにする。
  6. 細胞数を計測する。
  7. 5×105個を15 mlチューブに入れ、PBSを加えて10 mlにする。
  8. 200×g、室温で10分間遠心し回収する。
    この間に、以下のエレクトロポレーション液(線維芽細胞用)を作製する。
    Human Dermal Fibroblast Nucleofector Solution*482 μl
    Supplement*418 μl
    Human iPS Cell Generation Episomal Vector Mix3.5 μl
  9. 遠心終了後、上清を取り除く。
  10. 8. のエレクトロポレーション溶液(線維芽細胞用)に細胞を懸濁し、キュベット*4に移す。
  11. Nucleofector II Deviceにキュベットを差し込み、プログラムU-023でエレクトロポレーションを行う。
  12. 1. のDMEM/10%FBS培地に、エレクトロポレーション後の細胞を素早く懸濁する。
  13. 6 well tissue culture plateの1 wellに細胞を播種し、インキュベーター(37℃、5% CO2)で培養する。
    *4Human Dermal Fibroblast Nucleofector Kitには、Human Dermal Fibroblast Nucleofector solution、Supplement、キュベットが含まれています。




(Day 2)培地交換
培養上清を吸引除去し、2 ml の10% FBS/DMEM培地を添加する。
以降、培地の交換は2日に1回行う。


(Day 6)Feeder細胞の準備
  1. 6 well tissue culture plateに0.1% ゼラチン水溶液を添加し、37℃で30分間インキュベートする。
  2. 6 well tissue culture plate から0.1% ゼラチン水溶液を吸引除去する。
  3. ゼラチンコート済みの6 well tissue culture plateに、10% FBS/DMEM培地にてFeeder細胞を3×105 個/wellで播種する。
  4. インキュベーター(37℃、5% CO2)で一晩培養し、細胞を容器底面に接着させる。


(Day 7)Feeder細胞上への継代
  1. Day 0で培養開始した6 well tissue culture plateから培地を吸引除去し、PBSを2 ml加える
  2. PBSを吸引除去し、0.5 ml/wellの0.25% Trypsin/1 mM EDTA solutionを加える。
  3. 37℃で3分間インキュベートする。
  4. 10% FBS/DMEM培地を2 ml加え、ピペッティングによりシングルセルにする。
  5. 細胞数を計測する。
  6. Day 6に準備したFeeder細胞上に、10% FBS/DMEM培地にて1.5×104個/wellを播種する。
  7. インキュベーター(37℃、5% CO2)で培養を開始する。


(Day 8)ヒトiPS細胞培養用培地での培養
培地を吸引除去し、ヒトiPS細胞培養用培地2 mlを添加する。
    以降、培地の交換は2日に1回行う。
    培養開始後20~30日目にiPSコロニーが認められる。
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