Probe qPCR Mix

1. 下記に示すPCR反応液を調製する。
   
   

   ＜1反応あたり＞

   試薬	使用量	使用量	最終濃度
   Probe qPCR Mix（2×）	10 μl	25 μl	1×
   PCR Forward Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   PCR Reverse Primer (10 μM)	0.4 μl	1 μl	0.2 μM*1
   プローブ	0.8 μl	2 μl	*2
   ROX Reference Dye（50×）*3	0.4 μl	1 μl	1×
   template	2 μl	4 μl	*4
   滅菌精製水	6 μl	16 μl
   Total	20 μl*5	50 μl*5

   
   
   *1 最終プライマー濃度は0.2 μMで良い結果が得られる場合が多いが、反応性に問題があるときは0.1～1.0 μMの範囲で最適な濃度を検討すると良い。

   *2 プローブ濃度は、使用するリアルタイムPCR装置の機種やプローブの蛍光標識物質により異なる。装置の取扱説明書やプローブの添付データシートを参考に添加量を検討する。

   *3 ROX Reference Dye（50×）は最終濃度１×で使用する。

   *4 template溶液中に存在するターゲットのコピー数により異なる。段階希釈して適当な添加量を検討する。反応液20 μlあたりDNA template 100 ng以下を用いることが望ましい。また、RT-PCRでcDNA (RT反応液) をtemplateとして添加する場合は、PCR反応液量の10%以下になるようにする。

   *5 各装置の推奨容量に従って調整する。
2. 反応を開始する。
   PCRは、下記のシャトルPCR標準プロトコールで行うことをお勧めする。まず、このプロトコールを試し、必要に応じてPCR反応条件を至適化してください。(「PCR反応条件について」を参照。)

   ＜7300 Real-Time PCR System＞

   シャトルPCR標準プロトコール
   
   　　Stage 1 ：初期変性
   　　　　Reps：1
   　　　　95℃　30秒
   　　Stage 2 ：PCR反応
   　　　　Reps：40
   　　　　95℃　 5秒
   　　　　60℃　31秒
   

   ＜StepOnePlus Real-Time PCR System＞

   Fastプロトコール
   
   　　Holding Stage
   　　　　Reps ： 1
   　　　　95℃、20秒
   　　Cycling Stage
   　　　　Number of Cycles：40
   　　　　95℃、1秒
   　　　　60℃、20秒

   
   
   
3. 反応終了後、解析を行う。
   反応終了後、増幅曲線を確認し、定量を行う場合は検量線を作成する。
   * 解析方法は、リアルタイムPCR装置の取扱説明書を参照してください。

＜PCR反応条件について＞