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Protocols

NucleoSpin® miRNA

small RNA, large RNAの同時精製プロトコール(動物組織、培養細胞から)

NucleoSpin miRNA(製品コード 740971.10、740971.50、740971.250)
試薬の準備

 

Buffer MW2*1、rDNase溶液*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。

1.サンプルの溶解*3

乳鉢

組織サンプルの場合
30 mgまでの組織を用意し、それぞれの組織に適した方法で細分化処理を行う。
(例)液体窒素を加え、凍結しながら乳鉢で粉状にする、など。

チューブ

細胞サンプルの場合
107個までの培養細胞を遠心で回収する。または、ディッシュ上で直接溶解する場合は、ディッシュ上の培地を出来る限り吸引除去する。

 

組織、または細胞にBuffer ML 300 μlを添加して、5回以上のピペッティングまたはvortexにより溶解する。
室温で5分間静置する。

2.溶解液のろ過

チューブ

NucleoSpin Filter(紫色のリング)をCollection Tube(2 ml:蓋付)にセットする。
1.のライセートをNucleoSpin Filterに加え、11,000×g、1分間遠心する。
NucleoSpin Filterを取り除く。

遠心マーク
3.エタノールの添加

チューブ

ろ液300 μl*4に対してエタノール150 μlを添加する。すぐにvortexで5秒間混合する。
室温で5分間静置する。
(エタノール添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて4.のカラムに添加する。)室温で5分間静置する。

4.カラムへの吸着

チューブ

NucleoSpin RNA Column(青色のリング)をCollection tube(2 ml:蓋付)にセットする。
3.の溶液をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する*5
この操作でlarge RNAとDNAがNucleoSpin RNA Columnに吸着する。small RNAとタンパク質はろ液に含まれる。

遠心マーク
Large RNAの精製(ゲノムDNA除去)
5.サンプルの溶解

チューブ

カラムを新しいCollection tube(2 ml)にセットする。
Buffer MDB 350 μlをカラムに添加する。
11,000×g、1分間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

遠心マーク
6.DNAの分解

チューブ

rDNase溶液*2 100 μlをカラムに添加する。蓋を閉めずに室温で15分間以上反応させる。
(10.カラムへの吸着へ)

small RNAの精製(除タンパク)
7.タンパク質の不溶化

チューブ

4.のろ液にBuffer MP 300 μlを加え、蓋を閉めて、vortexで5秒間混合する。

8.タンパクの除去

 

11,000×g、3分間遠心してタンパク質を沈殿させる。*6

遠心マーク

チューブ

NucleoSpin Protein Removal Column(白色のリング)をCollection tube(2 ml:蓋付)にセットする。
上清をカラムに添加し、11,000×g、1分間遠心する。

遠心マーク
9.Bufferの添加

チューブ

NucleoSpin Protein Removal Columnを取り除き、800 μlのBuffer MXを添加する。
すぐにvortexで5秒間混合する*7
(Buffer MXの添加後、凝集物が見える場合もスピンダウンは行わず、すべて10.のカラムに添加する。)

small RNAのカラムへの吸着とsmall RNAとlarge RNAの精製
10.カラムへの吸着
(small RNAのlarge RNA
吸着カラムへの結合)

チューブ

Large RNAを結合済みの6のNucleoSpin RNA Column(青色のリング)に9.の溶液600 μlを添加し、11,000×g、30秒間遠心する
(rDNase溶液添加された状態のカラムに9の溶液を加えること)。ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。
この操作を繰り返し、すべての9.の溶液をカラムに加える。

遠心マーク
11.メンブレンの洗浄

 

1回目の洗浄
Buffer MW1 600 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

遠心マーク

チューブ

2回目の洗浄
Buffer MW2*1 700 μlをカラムに添加する。
11,000×g、30秒間遠心した後、ろ液を捨て、同じチューブにカラムをセットする。

遠心マーク

 

3回目の洗浄
Buffer MW2*1 250 μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心して、カラムを乾燥させる。

遠心マーク
12.RNAの溶出
(small RNA+large
RNAの精製)

チューブ

カラムを新しいCollection tube(1.5 ml)にセットする。
RNase-free H2O 30~100 μl*8 をカラムに加え、蓋を閉めずに室温で1分間静置する。
蓋を閉めて11,000×gで30秒間遠心してRNAを溶出する。

遠心マーク

*1 Buffer MW2
Wash Buffer RA3(Concentrate)に4倍量の96~100%エタノールを添加して、よく混合する。Buffer MW2は室温で1年間安定である。

*2 rDNase溶液
rDNase(凍結乾燥品)1 vialにReaction Buffer for DNase 3 mlを加え、室温で1分間インキュベートし、その後穏やかに混合し、完全に溶解する。 調製したrDNase溶液は小分けして、-20℃に保存する(6ヵ月間安定)。凍結融解は3回までとする。

*3 サンプルの溶解
サンプルの溶解方法はここで挙げた方法以外にも、各組織にあった方法を使用してもよい。詳細は英文説明書を参照のこと。

*4 300 μl以上のろ液を処理する場合には、ステップ3のエタノール、ステップ7のBuffer MP、ステップ9のBuffer MXを比例して増量する。また一度でカラム処理ができない場合には、その作業を繰り返す。

*5 カラム内部に溶液が残る場合には、カラムを180℃回転させてgのかかる方向を変え、再度遠心する。

*6 沈殿にはタンパク質が含まれており、容易にSDS-PAGE、ウェスタン解析などに使用できる。詳細は英文説明書参照のこと。

*7 微量サンプル(3 mg以下の組織、1×107個以下の細胞)から精製をしている場合、10 μg Carrier RNAを添加することで、収量を改善することができる。詳細は英文説明書参照のこと。

*8 RNAの収量や濃度を上げたい場合は、溶出液量変更することも可能である(英文説明書参照)。

<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書を確認すること。
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