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Protocols

NucleoSpin® Plasmid Transfection-grade

プラスミド精製プロトコール

NucleoSpin Plasmid Transfection-grade(製品コード 740490.10/.50/.250)
試薬の調製 Buffer A1(+RNase A)*1 、Buffer AQ*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。
Buffer A2に沈殿が生じていないことを確認する*3
1.培養液の調製
集菌
大腸菌の培養液1~5 mlを11,000×gで30秒間遠心し、上清をできるだけ除去する。
2.菌の溶解
細胞ペレットにBuffer A1(+RNase A)*1250 μlを加え、ボルテックスまたはピペッテイングで完全に溶解する。
Buffer A2*3 250 μlを加え、チューブを6~8回反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
2分間またはライセートが清澄化するまで室温で静置する。
Buffer A3 300 μlを加え、LyseControlの青色が完全に無色になるまでチューブを反転して穏やかに混合する。ボルテックスはしてはならない。
3.ライセートの清澄化
2.の溶液を遠心機の最高速度で、10分間室温で遠心する。上清が透明になるまで、この遠心を繰り返す。
4.カラムへの吸着
NuleoSpin Plasmid TG ColumnをCollection Tube (2 ml)にセットする。
3.の上清をカラムに添加する。この時、大腸菌の残滓を持ち込まないように注意する。
11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨て、カラムを同じCollection Tubeにセットする。
5.メンブレンの洗浄





1回目の洗浄
Buffer ERB 700 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨て、カラムを同じCollection Tubeにセットする。

2回目の洗浄
Buffer AQ*2 650 μlをカラムに添加し、11,000×gで1分間遠心する。
ろ液を捨て、カラムを同じCollection Tubeにセットする。
Collection Tubeからカラムの先がろ液に触れないように、カラムを注意深くはずす。
6.メンブレンの乾燥
カラムをさらに11,000×gで1分間遠心する。
7.DNAの溶出
カラムをマイクロチューブ(1.5 ml:各自で用意)にセットする。
Buffer AE 50 μlを添加し、室温で1分間インキュベートした後、11,000×gで1分間遠心する。溶出液をプラスミド溶液として保存する。
Buffer AEの組成:5 mM Tris-HCl、pH8.5
*1
Buffer A1(+RNase A)の調製法
RNase A (凍結乾燥品)のチューブに3 mlのBuffer A1を加えて完全に溶解し、溶解した溶液全量をBuffer A1のボトルに移す。RNase Aを添加したBuffer A1は、4℃で6ヵ月安定である。

*2
Buffer AQの調製法
製品コード 740490.10(10回用)の場合: Buffer AQ (Concentrate) 6 mlに96~100%エタノール 24 mlを添加する。
製品コード 740490.50(50回用)、740490.250(250回用)の場合の調製法は英文説明書を参照すること。

<注意>
使用時には、詳細は必ず添付の英文説明書を確認すること。
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