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細胞のシングルセルクローニング方法

  1. Cas9タンパク質とsgRNA複合体(RNP)を目的細胞に導入する。
  2. RNP導入後、4~7日後に継代し、その時に一部細胞を回収してゲノム編集の可否判定を実施する。判定にはGuide-it Mutation Detection Kit(製品コード 631448)を使用する。
  3. 2でゲノム編集が起こっているpool細胞を用いて、導入後7~10日後からシングルセルクローニングを実施する。
    ヒント:Cas9遺伝子をPlasmidで導入する場合は、Cas9の活性がしばらく残存している可能性があるため、導入後2週間以上経過してから開始する。
    • シングルセルクローニングは、0.5 cell/well程度になるような細胞濃度で播種する(これは、1 cell/wellで播種すると複数細胞の入ったウェルが多くなるため。但し、顕微鏡観察で確実に各ウェルを観察するのであれば、1 cell/wellで播種しても差し支えない)。
    • プレートは96 well plateを使用し、100 μl/well程度を分注する。
    • 細胞観察しながら、シングルセル由来のクローンのウェルを確認する。途中で培地を添加し、細胞がある程度増殖したら48 well plateや24 well plate等に移し拡大培養する。
      ヒント:どうしてもシングルセルクローニングができない細胞の場合は、10 cm plate等に薄く播いてコロニーをクローニングリングで単離することも可能
  4. 各クローンを増やして凍結細胞ストックを作製し、一部の細胞をシーケンス解析用に分取する。
  5. クローン化した細胞のシーケンス解析を実施。
    シーケンス解析用のサンプル調製キットは以下のキットを使用する。
    Guide-it Indel Identification Kit(製品コード 631444)
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