神経分化培地　NDiff^® 227（論文報告名：N2B27）

NDiff 227を用いて、Cellartis DEF-CS 500 Culture Systemで維持培養したヒトiPS細胞株Cellartis human iPS cell line 18 (ChiPSC18)をnaïve型iPS細胞へ誘導を行った。

※6ウェルプレートで培養する場合のプロトコールを示す。

Day-2～-1

• 0.1％ Gelatin coatした培養容器にマイトマイシンC処理済みのMouse embryo fibroblast（MEF；C57BL6株）を2～3×10⁵ cells/well（2～3×10⁴ cells/cm²を目安）で播種

Day0　Setup

• DEF-CS培地で維持培養していたiPS細胞株をDEF-CS培地のUser Manualに従ってシングルセルに分散し、DEF-CS完全培地（GF-1、GF-2、GF-3含有）にて細胞を懸濁
• 事前に播種したMEF細胞培地を除き、PBSで2回洗浄
• DEF-CS完全培地をMEF上に適量添加する
• iPS細胞懸濁液を1×10⁵ cells/well（1×10⁴ cells/cm²を目安）になるように調製し、MEF上に播種
• DEF-CS完全培地を2～2.5 ml/well（0.2～0.25 ml/cm²を目安）になるように添加
• 37℃、5％ CO₂、5％ O₂環境下で培養する

Day1　培地交換

• DEF-CS培地にGF-1、GF-2を加え、37℃で加温
• 培養液を全量除き、加温したDEF-CS培地を2～2.5 ml/well（0.2～0.25 ml/cm²を目安）添加
• 37℃、5％ CO₂、5％ O₂環境下で培養を継続する。

Day2～4 ①培地交換（毎日）

• 下図に従い①培地を調製する（調製後4℃保存にて1週間程度使用可能）
• 室温になるまで静置する
• 培養液を全量除き、①培地を2～2.5 ml/well（0.2～0.25 ml/cm²を目安）添加
• 37℃、5％ CO₂、5％ O₂環境下で培養を継続する。

Day5～ ②培地交換（継代日を除き毎日）

• 下図に従い②培地を調製する（調製後4℃保存にて1週間程度使用可能）
• 室温になるまで静置する
• 培養液を全量除き、②培地を2～2.5 ml/well（0.2～0.25 ml/cm²を目安）添加
• 37℃、5％ CO₂、5％ O₂環境下で培養を継続する。

※多数の死細胞が出現するが問題なし

Day6～10　継代

　※継代のタイミング
　　培養日数の経過とともに、培養面のMEFの細胞数が減少していきます。
　　1回目の継代は、MEFが培養開始時の30～50％に減少した際に実施してください。
　　2回目以降の継代は、2～3日毎に実施してください。
　　また、Day-2～-1と同様に、継代する1～2日前にMEFを播種したプレートをご用意ください。

• 培養液を全量除き、PBSで2回洗浄する
• Accutase-Solutionを1 ml/well（0.1 ml/cm²を目安）添加し、37℃、5％ CO₂、5％ O₂で3～10分静置する
• 細胞の剥離を確認した後、②培地の培地もしくは0.5％ BSAを含むDMEM/F12を適量添加し細胞懸濁液を15 ml遠沈管に回収する
• 培養器材を同様の適量の培地にてリンスし、上記の15 ml遠沈管に回収
• 200～300g、3～5分、20℃にて遠心
• 培養上清を取り除き、細胞をタッピングによりほぐした後、②培地に10 μM Y-27632を含んだ培地を適量添加し懸濁
• 事前に播種したMEF細胞培地を除き、PBSで2回洗浄
• MEF上に培地交換②の培地を適量添加しておく
• 細胞懸濁液 全量～1/5程度の液量を播種
• ②培地をtotal 2～2.5 ml/well（0.2～0.25 ml/cm²を目安）になるように添加
• 37℃、5％ CO₂、5％ O₂環境下で培養を開始する
• 以降、Day20程度まで2～3日毎に継代を行い培養を継続する

Day20～

• 継代のタイミングで下図に従い③培地を調製する（調製後4℃保存にて1週間程度使用可能）
• 継代時に②培地を③培地に変更し、以降同様に培養を継続する

＜培養実施例＞

Day-2 or Day-1	MEF播種
Day0	iPS細胞をMEF上に播種
Day1	培地交換
Day2	①培地の調製、培地交換
Day3～4	①培地にて毎日培地交換
Day5	②培地の調製、培地交換
Day6	MEF播種、②培地にて培地交換
Day6～8	②培地にて毎日培地交換もしくは継代
Day8～10	継代翌日以降②培地にて毎日培地交換 3～4日置きに継代実施。
Day20	継代のタイミングで②培地を③培地に変更し、同様に培養を継続