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TaKaRa LA Taq®

GC richなフラグメントの増幅例

テンプレートDNAがGC richである場合、従来のTaqDNA Polymeraseを用いたPCRでは増幅しにくいことがよくある。TaKaRa LA TaqおよびTaKaRa Ex Taqは従来のTaqDNA Polymeraseに比べて増幅効率が優れているため、一般的に増幅しにくいこのようなDNAフラグメントの増幅も可能である。
以下に、GC含量が70%ときわめて高い3 kbpのフラグメントを増幅した例を示す。
図1は通常のTaqDNA PolymeraseとTaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2での増幅を比較した。通常のTaqでは増幅できないGC richなフラグメントがTaKaRa Ex Taq、TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2では良好な増幅が確認できる。
このようにGC richなフラグメントでは、図1のようにdGTPの代わりに7-deaza-dGTPを使用するとよい結果が得られる場合がある。また、より増幅効率を高めたい時は、dGTPと7- deaza-dGTP (あるいはdITP) とを混合して用いるとよい結果が得られる (図2) 。
増幅したいフラグメントの種類により最適なdGTPと7-deaza-dGTP (あるいはdITP) との混合比率は変化するので、さまざまな条件を検討し、至適条件を決定することをお勧めする。

*Primer配列
 M3-30 (M3 Primerを長くしたもの)
    5'-CAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3'
 RV-32 (RV Primerを長くしたもの)
    5'-GATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'

Template VIII-5-pUC118
(GC richなフラグメント約3 kbpをHind IIIで切断したpUC118に挿入したもの)
増幅サイズ 約3 kbp
Primer* Custom long primer (30~32 mer)
(各10 pmol/50 μl PCR)
dNTP Mixture dGTPの代わりに7-deaza-dGTP使用
PCR条件 94℃、1 min
 ↓
98℃、20 sec
68℃、5 min
30 cycles
(TaKaRa PCR Thermal Cycler 480使用)


図1 GC richなフラグメントの増幅の比較

1% L 03 Agarose gel (製品コード 5003)
8 μl泳動

Lane 1:Taq
Lane 2:TaKaRa Ex Taq
Lane 3:TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2
を用いて増幅
Lane M1:λ-Hind III digest
Lane M2:λ-EcoT14 I digest


図2 dGTPと7-deaza-dGTP、dITPとの割合とGC richなフラグメントの増幅の比較

1% L 03 Agarose gel (製品コード 5003)
10 μl泳動

Lane 1:dGTP:dITP = 3:1
Lane 2:dGTP:7-deaza-dGTP = 3:1
Lane 3:7-deaza-dGTPのみ
TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2を用いて増幅
Lane 4:dGTP:dITP = 3:1
Lane 5:dGTP:7-deaza-dGTP = 3:1
Lane 6:7-deaza-dGTPのみ
TaKaRa Ex Taq を用いて増幅
Lane M:pHY Marker
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