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Application

DNA Blunting Kit

電気泳動による平滑末端化の確認

操作手順
M13 mp18 ssDNA(製品コード 3518)と、5'末端を〔32P〕で標識したM4プライマーを、アニーリングした後、Klenow Fragmentで相補鎖を合成する。合成した二本鎖を、制限酵素EcoR I 、Pst I、Hinc II で、それぞれ切断する。Protocolにしたがって、それぞれの平滑末端化(5分間、20分間)を行い、行っていないものとの両方について、変性ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動を行い、鎖長を比較した。
結果
平滑末端化を行うと、EcoR I で切断したDNA(5'突出末端)は3'陥没部分に塩基が付加され、Hinc II で切断したDNA(平滑末端)はそのままで、Pst I で切断したDNA(5'陥没末端)は3'突出部分の塩基が削られていることが、電気泳動の結果により確認された。

図1 電気泳動による鎖長の比較

M: M13 mp18 ssDNA
(dideoxy法によるシークエンス)
E: EcoR I
0: 平滑末端化(-)
P: Pst I
5: 5分間反応
H: Hinc II
20: 20分間反応

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