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Application

EcoR I -Not I -BamH I Adaptor

Adaptorを用いたcDNA cloning

Methylation反応、制限酵素反応を行うことなしに、アダプターライゲーション後、直接ベクターに挿入することが可能である。
1.アダプターライゲーション*
操作手順
0.01~0.1 pmol分
cDNAの100倍量以上(モル比)
66 mM
6.6 mM
10 mM
0.1 mM
350 U
二本鎖cDNA溶液
EcoR I-Not I-BamH I adaptor
Tris-HCl(pH7.6)
MgCl2
DTT
ATP
T4 DNA Ligase

Total 10 μl

16℃ for 2 hr~overnight

0.5 M EDTA 1 μlを加えて反応を停止

フェノール/クロロホルム抽出

1/10量の3 M酢酸ナトリウム溶液、2倍量のエタノールを加える

-20℃で30分間冷却後、20分間遠心

ペレットを80%エタノールで洗浄後、真空乾燥

適当量のTE Bufferに溶解


* TaKaRa DNA Ligation Kit(製品コード 6021、6022)を用いる場合には、TaKaRa DNA Ligation Kit 関連 Protocolの「リンカーライゲーション」を参照。
2.アダプター部分のリン酸化反応
操作手順
50 mM
10 mM
5 mM
0.1 mM
0.01~0.1 pmol
5~20 U
Tris-HCl(pH8.0)
MgCl2
DTT
ATP
adaptor付加二本鎖cDNA溶液
T4 Polynucleotide Kinase

Total 50 μl

37℃ for 30 min

0.5 M EDTA 5 μlを加えて反応を停止

70℃ for 5 min

フェノール/クロロホルム抽出

1/10量の3 M酢酸ナトリウム溶液2倍量のエタノールを加える

-20℃で30分間冷却後、20分間遠心

ペレットを80%エタノールで洗浄後、真空乾燥

適当量のTE Bufferに溶解

ゲルろ過、スピンカラムクロマトグラフィー、
アガロースゲル電気泳動等による未反応のアダプター除去

cDNA断片の回収

λ-ベクターへの挿入(cDNA Synthesis KitのApplication「cDNAのλ-ベクターへの挿入」を参照)
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