ヒトβ-actin mRNAの5'領域のクローニング
HeLa細胞のpolyA＋RNAを用いて、ヒトβ-actin mRNAの5'領域をクローニングした。
■ プライマーの配列RT primer：5'-(P)CAGGGCAGTGAT-3'
S1 primer：5'-GATGGCCACGGCTGCTTCCA-3'
S2 primer：5'-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3'
A1 primer：5'-GGTTGGCCTTGGGGTTCAGG-3'
A2 primer：5'-TCTCCATGTCGTCCCAGTTG-3'
1. 1st strand cDNAの合成
| HeLa cell polyA＋RNA | 0.5 μg |
| 10×RT Buffer | 1.5 μl |
| RNase Inhibitor （40 U/μl） | 0.5 μl |
| AMV Reverse Transcriptase XL （5 U/μl） | 1 μl |
| RT primer（1 μg/μl） | 1 μl |
| RNase free dH2O | up to 15 μl |
30℃、10 min
↓
50℃、30 min
↓
80℃、 2 min
↓
4℃
2．Hybrid RNAの分解
| 1st strand cDNA溶液 | 15 μl |
| 5×Hybrid RNA Degradation Buffer | 15 μl |
| 滅菌精製水 | 45 μl |
| Total | 75 μl |
RNase Hを1 μl加え、30℃で1時間反応を行う。
反応終了後、エタノール沈殿を行う。
3．ライゲーション反応による一本鎖cDNAの環化（またはコンカテマー化）
| 5×RNA （ssDNA） Ligation Buffer | 8 μl |
| 40％ PEG #6000 | 20 μl |
| 滅菌精製水 | 12 μl |
| Total | 40 μl |
エタノール沈殿により回収した一本鎖cDNAの沈殿に上記反応液を加えてよく混和し、T4 RNA Ligaseを1 μl加えて16℃で一晩（15～18時間）反応を行う。
4．PCRによる増幅反応
ライゲーション反応液をTE bufferにて10倍希釈したものをtemplateに使用する。
（TaKaRa LA PCR Kit Ver. 2を使用）
| template | 1 μl |
| 10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus） | 5 μl |
| dNTP Mixture（各2.5 mM） | 8 μl |
| S1 primer（20 pmol/μl） | 0.5 μl |
| A1 primer（20 pmol/μl） | 0.5 μl |
| TaKaRa Taq（5 U/μl） | 0.5 μl |
| 滅菌精製水 | up to 50 μl |
PCR条件【TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice使用】
| 94℃、3 min ↓ | |
| 94℃、30 sec | 25 cycles |
| 65℃、30 sec | |
| 68℃、30 sec |
■ 2nd PCR反応液組成
| 1st PCR solution | 1 μl |
| 10×LA PCR Buffer II（Mg2＋plus） | 5 μl |
| dNTP Mixture（各2.5 mM） | 8 μl |
| S2 primer（20 pmol/μl） | 0.5 μl |
| A2 primer（20 pmol/μl） | 0.5 μl |
| TaKaRa Taq（5 U/μl） | 0.5 μl |
| 滅菌精製水 | up to 50 μl |
PCR条件【TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice使用】
| 94℃、30 sec | 27 cycles |
| 65℃、30 sec | |
| 68℃、30 sec |
5. 結果
 |
2％ アガロースゲル 5 μl泳動 |
得られたフラグメントをTAクローニングによりサブクローニングし、シーケンスを確認した。
得られたフラグメントは、報告にあるβ-actin mRNA CAPサイトまでの配列を含んでいることが確認できた。
